La colonne est un composant crucial de la (U)HPLC, car c'est là que se produit la séparation chromatographique. Cependant, les colonnes sont des consommables avec une durée de vie limitée. Cela est particulièrement pertinent pour les colonnes coûteuses, où maximiser la longévité est essentiel. Une manipulation et un entretien appropriés ont un impact significatif à la fois sur la durée de vie de la colonne et sur le nombre d'injections réussies.

La première section de "Durée de vie de la colonne" se concentre sur les meilleures pratiques générales pour manipuler les colonnes HPLC, y compris les stratégies pour prévenir les obstructions dues aux particules et à la cristallisation, les mesures de maintenance proactives et les actions correctives lorsque des problèmes surviennent.

1. Respect des spécifications de la colonne

Chaque colonne de séparation analytique a des conditions de fonctionnement spécifiques qui doivent être respectées pour garantir des performances optimales. Les paramètres clés incluent :

Plage de pression
Valeur de pH
Température
Solvants

Fonctionner en dehors de ces paramètres peut entraîner des décalages de sélectivité, une perte de temps de rétention, ou même des dommages permanents à la colonne.

De plus, une manipulation appropriée est essentielle pour préserver l'intégrité de la colonne. Évitez les fluctuations de pression soudaines, car cela peut provoquer des fissures dans les matériaux de remplissage ou créer des volumes morts. Pour prévenir cela :

Laissez toujours le système HPLC se dépressuriser complètement avant de déconnecter la colonne.
Lors du démarrage du système ou du chauffage du four, équilibrez la colonne à un débit inférieur à celui de la méthode. Une viscosité de solvant plus élevée au début peut entraîner une pression élevée et des chocs de pression potentiels.
Certains systèmes HPLC, comme le HPLC Shimadzu, disposent d'une fonction intégrée appelée FlowPilot, qui augmente progressivement le débit pendant que le système atteint la température cible du four. Cette montée contrôlée minimise le stress sur la colonne, aidant à prolonger sa durée de vie. Pour plus de détails, regardez la vidéo en bas de la page.

Les dommages physiques peuvent également raccourcir la durée de vie d'une colonne. Évitez de faire tomber la colonne, car l'impact peut compromettre sa structure interne. Stockez toujours vos colonnes conformément aux recommandations du fabricant dans le solvant approprié. Conservez la colonne bien fermée avec les bouchons fournis et de préférence dans l'emballage fourni.

2. Obstruction de la colonne due aux particules

De petites particules de saleté provenant du système, de l'éluant ou de l'échantillon peuvent entraîner une obstruction de la colonne, réduisant ainsi les performances et la durée de vie. Les mesures préventives suivantes peuvent aider à éviter de tels problèmes.

Élimination des particules des échantillons et des élutions

Étant donné que la longévité de la colonne dépend de la qualité de l'échantillon, une préparation appropriée de l'échantillon est essentielle. Les particules doivent être éliminées avant l'injection. Les filtres à seringue offrent une solution simple et économique, mais si le filtrage n'est pas adapté à vos échantillons, envisagez des techniques alternatives telles que la centrifugation ou l'extraction en phase solide (SPE).

De même, l'éluant doit être exempt de particules pour éviter les obstructions dans la colonne et le système. Les impuretés organiques dans l'eau peuvent également provoquer des pics fantômes inattendus dans les chromatogrammes. Ce problème a été précédemment abordé dans la Partie 7 de ce cours de troubleshooting.

Utilisation de précolonnes et de pièges à fantômes

Les précolonnes (colonnes de garde) sont placées avant la colonne analytique principale pour piéger les impuretés et prolonger la durée de vie de la colonne. Celles-ci sont généralement remplies du même matériau de remplissage que la colonne principale et ne doivent pas dépasser un dixième de sa taille. Les précolonnes sont facilement remplaçables et beaucoup moins coûteuses que le remplacement d'une colonne analytique. Si vous utilisez une précolonne, tenez toujours compte de son impact mineur sur la séparation chromatographique lors du développement de la méthode.

De plus, des pièges à fantômes peuvent être installés entre la pompe et l'injecteur pour éliminer les impuretés de la phase mobile, protégeant ainsi davantage le système.

Prévenir la cristallisation

Lors du changement d'éluants, considérez toujours la compatibilité de miscibilité pour éviter la précipitation. Les tampons ne doivent jamais être remplacés directement par des solvants organiques, car cela peut entraîner la précipitation des sels de tampon. Purgez toujours le système avec de l'eau entre les changements de tampon et de solvant.

Evitez de laisser un mélange d'éluant contenant une solution saline aqueuse dans le système après analyse, car une exposition prolongée peut entraîner une cristallisation et des obstructions potentielles du système.

Contre-mesures pour les obstructions de colonne :

Vérifiez les obstructions dans d'autres composants du système : Avant de supposer que la colonne est obstruée, inspectez d'autres parties du système, telles que les tubes, les filtres et l'injecteur, pour détecter des obstructions.
Rincez avec un solvant approprié : Le rinçage de la colonne avec un solvant approprié peut aider à dissoudre et à éliminer les contaminants. Consultez toujours les spécifications de la colonne pour déterminer les solvants compatibles.
Si le fabricant le permet, connectez la colonne dans le sens inverse et rincez-la à un faible débit pour éliminer les substances insolubles. Assurez-vous que l'éluant contenant des impuretés est dirigé vers la poubelle et ne passe pas par le détecteur pour éviter la contamination. Consultez toujours les informations sur le produit de la colonne pour des directives spécifiques.

Dans la prochaine partie, nous aborderons d'autres facteurs qui peuvent contribuer à la longévité de la colonne.

Votre équipe Shimadzu LC