Le temps de rétention est crucial pour une analyse HPLC précise, car il est utilisé pour identifier les analytes. Les méthodes de détection les plus couramment utilisées en HPLC incluent l'absorbance UV/VIS, la fluorescence et la détection par indice de réfraction. Les méthodes optiques comme l'absorbance UV/VIS et la fluorescence sont souvent spécifiques à la substance, idéales pour les composés contenant des chromophores ou des fluorophores, tandis que la détection par indice de réfraction est plus générale et non sélective. Les fluctuations du temps de rétention peuvent conduire à des résultats peu fiables ou inexactes, rendant essentiel de maintenir sa reproductibilité pour des mesures cohérentes et précises.

Cette section, ainsi que les unités de cours à venir, exploreront les différents facteurs qui influencent les fluctuations du temps de rétention.

1. Influence de la température sur les temps de rétention

La température joue un rôle significatif en HPLC, car elle impacte directement le temps de rétention. À mesure que la température augmente, la viscosité de la phase mobile diminue, entraînant une réduction de la pression. En général, un changement de température de 1 °C entraîne un décalage de 1 à 2 % du temps de rétention. Cet effet est plus prononcé pour les analytes qui s'éluent tardivement, car ils sont plus sensibles aux fluctuations de température. Le chromatogramme suivant montre quatre parabènes mesurés à différentes températures.

En comparant la mesure à 20 °C et à 50 °C, le temps total d'analyse est presque réduit de moitié. Cet effet de température peut être exploité pour optimiser ou raccourcir les méthodes, tant que les spécifications de la colonne sont respectées. Cependant, à des températures très élevées, la durée de vie de la plupart des colonnes est susceptible d'être réduite.

Si vous choisissez d'utiliser la température pour l'optimisation de la méthode, sachez que tous les analytes ne réagissent pas de la même manière aux changements de température. Comme montré dans l'exemple à droite, alors que l'acide sorbique et l'acide benzoïque sont séparés à 20 °C, ils coéluent à 30 °C, et l'augmentation de la température peut même inverser leur ordre d'élution. De tels changements peuvent entraîner des résultats incorrects s'ils ne sont pas soigneusement surveillés.

Pour maintenir la cohérence et minimiser les fluctuations liées à la température, il est recommandé d'utiliser un four à colonne pour garder la température de la colonne aussi stable que possible.

1 : Acide sorbique, 2 : Acide benzoïque, 3 : Méthylparabène

2. Influence du débit sur le temps de rétention

En HPLC, chaque pompe est composée de pièces consommables qui doivent être remplacées régulièrement pour maintenir la performance. Par exemple, les joints de piston sont conçus pour délivrer un volume spécifié, mais à mesure qu'ils s'usent, ils peuvent devenir fuyants, affectant le débit. Si les temps de rétention fluctuent, le problème peut provenir d'une pompe défectueuse.

Le moyen le plus simple de vérifier la performance de la pompe est de la calibrer. Utilisez une éprouvette graduée et connectez un capillaire à contre-pression directement à la pompe, en définissant un débit précis. Ensuite, comparez le temps nécessaire pour délivrer un volume spécifique par rapport au débit attendu pour vérifier les écarts.

Il est important d'inspecter régulièrement les consommables de votre système HPLC et de garder des pièces de rechange à portée de main pour remplacer rapidement tout composant défectueux.

Des méthodes non robustes et des mesures incohérentes peuvent créer des conditions chromatographiques instables. Dans de telles conditions, même de petits changements—tels que des fluctuations de température ou de composition de l'éluant—peuvent avoir un impact significatif sur le temps de rétention. Cela peut entraîner la nécessité de répéter des échantillons ou de retravailler l'évaluation, ce qui peut être particulièrement problématique dans des environnements réglementés.

Investir du temps dans le développement de méthodes robustes dès le départ sera bénéfique en réduisant les efforts de troubleshooting et en économisant du temps lors des analyses de routine. On parle ainsi de Robustesse de méthode analytique.

Choses à considérer quotidiennement :

Général :

Effectuer des tests de conformité réguliers pour garantir des résultats fiables
Vérifier les consommables à intervalles réguliers pour prévenir les problèmes liés à l'usure
Documenter les paramètres clés tels que les temps de rétention et la résolution pour des solutions de référence

Système :

Utiliser un four à colonne pour maintenir un contrôle de température précis et stable
Tenir un journal de la colonne
Conserver des enregistrements de l'entretien du système

Dans le module à venir, nous explorerons d'autres facteurs affectant les fluctuations du temps de rétention, y compris l'influence de la composition de l'éluant, les caractéristiques de la colonne et le temps d'équilibrage du système.

Votre équipe Shimadzu LC