Mesures de maintenance préventive

1. Prévention des obstructions

Si des petites microparticules sont introduites dans le circuit fluidique de la HPLC, elles peuvent provoquer le colmatage des capillaires, des vannes et des colonnes de séparation - des problèmes qui peuvent nécessiter des pièces coûteuses ou des remplacements de colonnes. Par conséquent, dans le cadre de votre préparation d'échantillons, les échantillons doivent être filtrés à travers un filtre à seringue de 0,22 µm minimum pour éliminer les particules. Les standards doivent également être filtrés de la même manière. Les filtres peuvent être achetés dans différents matériaux. Assurez-vous de choisir des filtres qui n'adsorbent pas vos analytes, ce qui pourrait entraîner des résultats faussement bas. 

Lors de l'utilisation d'une phase mobile à 100 % d'eau, il est facile pour les micro-organismes de se développer, ce qui peut entraîner des obstructions. Il est donc important d'utiliser de l'eau provenant d'un système de filtration d'eau de laboratoire (par exemple, de l'eau Milli-Q), d'acheter de l'eau de qualité HPLC ou d'ajouter un modificateur acide ou alcalin à la phase mobile, rendant plus difficile la croissance des micro-organismes. Il est également recommandé de renouveler régulièrement la phase mobile aqueuse pour atténuer ce risque. 

Lors de l'utilisation de tampons, il est important de considérer leur compatibilité avec les solvants organiques. Lors de l'utilisation de fortes concentrations de modificateurs organiques ou de forces ioniques de tampon, le tampon peut précipiter, entraînant des obstructions dans le système. Des tests préliminaires de compatibilité sont donc recommandés. 

Il est également important de considérer la miscibilité des solvants lors du changement de phases mobiles sur une HPLC. L'HPLC doit être rincée avec un solvant intermédiaire miscible s'il est probable que le nouveau solvant ne soit pas miscible avec le solvant d'origine. Par exemple, si vous passez d'un modificateur acide à un modificateur basique, le système doit être soigneusement rincé avec une phase mobile neutre.

2. Rinçage

La contamination du circuit fluidique ou de la colonne peut avoir un impact significatif sur la chromatographie. Si la colonne n'est pas propre, la pression peut augmenter considérablement, ou la sélectivité de la phase peut changer de manière permanente. Lors de l'utilisation d'échantillons ayant une forte affinité pour la colonne utilisée, l'intégration d'une étape de nettoyage avec un solvant puissant dans chaque méthode est essentielle. Si la colonne devient fortement contaminée, diriger le flux vers les déchets (by-passer le détecteur), ce qui empêchera la contamination de la cellule de détection. De plus, le circuit fluidique peut être rincé avec des solvants appropriés sans colonne en place, en utilisant un capillaire à contre-pression, ou l'union fournit avec les systèmes. 

3. Dégazage

L'air dissous dans la phase mobile a un impact significatif sur la stabilité de la ligne de base et le rapport signal/bruit. L'image à droite montre l'effet de l'air dissous dans l'eau et le THF sur la ligne de base d'un détecteur à indice de réfraction (RID) lorsque l'unité de dégazage a été mise en marche après que la ligne de base se soit stabilisée avec l'unité de dégazage éteinte. La diminution de l'air dissous lorsque le dégazeur a été mis en marche augmente l'indice de réfraction ; et le changement d'indice de réfraction est plus important pour le THF que pour l'eau. En général, plus la polarité d'un solvant est faible, plus l'effet d'un changement d'air dissous sur l'indice de réfraction est important.

De plus, un excès d'air dissous peut entraîner la formation de bulles d'air, semblable à la libération de pression d'une bouteille d'eau. Par conséquent, l'utilisation d'un dégazeur en ligne est fortement recommandée pour des performances optimales. Les bulles d'air piégées dans les pistons peuvent provoquer des pulsations considérables dans la courbe de pression, ce qui peut entraîner une mauvaise reproductibilité des résultats chromatographiques. Si cela se produit, le système doit être purgé pour éliminer les bulles piégées, ou utiliser un solvant tel que le 2-propanol (isopropanol) pour aider à éliminer les bulles d'air tenaces.

4. Contrôle de la température

La température est un facteur majeur en HPLC car elle affecte significativement à la fois la chromatographie et la sensibilité du détecteur. Les augmentations de température de la colonne diminuent la viscosité des élutions (phase mobile), entraînant une pression plus basse et des temps de rétention modifiés. Il en va de même pour les détecteurs, selon la température, la sensibilité et la ligne de base peuvent changer. C'est pourquoi les détecteurs ont leur propre contrôle de température. Les fluctuations de température ambiante peuvent également affecter la qualité de la chromatographie. Par conséquent, lorsque cela est possible, vous devez maintenir la température de votre système sous contrôle. Cela peut être réalisé par un four à colonne, des cellules chauffées et le bon choix d'emplacement d'installation. Évitez de placer le système dans des zones avec des courants d'air, en plein soleil ou près de sources de chaleur ou de refroidissement externes. 

5. Réglages du détecteur

Le réglage précis de la fréquence d'acquisition de données du détecteur est souvent négligé. Un réglage incorrect peut entraîner une variation significative de la surface de pic. La fréquence  d'acquisition de données doit être ajusté à la largeur de pic le plus étroit. S'il est trop bas, le pic ne sera pas représenté de manière reproductible, car le pic est mal tracé. Un réglage trop élevé entraînera une augmentation du bruit et un fichier de données beaucoup plus volumineux. Au moins 20 points de données sur la largeur du pic sont nécessaires pour tracer un pic en forme de gaussienne. Les points de données sont définis en modifiant les réglages du détecteur en Hz, où 1 Hz correspond à un cycle par seconde. Par conséquent, plus l'analyse chromatographique est courte, plus la fréquence d'acquisition de données / Hz doit être élevé. 

Suivre ces cinq mesures préventives peut éviter de manière proactive de nombreuses erreurs courantes en HPLC.  La réalisation régulière de tests de conformité du système peut également aider à évaluer les performances de votre système et à identifier plus efficacement les sources potentielles d'erreurs. 

Dans le prochain sujet de cours, nous commencerons par le premier sujet de troubleshooting – les perturbations de la ligne de base. 

Votre équipe Shimadzu LC