Fluctuations du temps de rétention - Partie 2

Au début de chaque mesure, il est important de s'assurer que la colonne est en équilibre. Lors du passage entre deux phases mobiles différentes, comme lors du rinçage du solvant de stockage, la colonne doit être rééquilibrée avec un nombre suffisant de volumes de colonne (généralement 10 volumes de colonne pour la chromatographie en phase inverse). Cela s'applique également aux méthodes utilisant un gradient, car il est important de rééquilibrer la colonne aux conditions initiales de la méthode. En général, les méthodes de chromatographie en phase inverse ont une longue étape de rinçage avec un solvant fort (haute teneur en organique) pour éliminer les analytes fortement retenus de la colonne. Pour s'assurer que le solvant fort n'impacte pas l'injection suivante, une étape de rééquilibrage suffisamment longue correspondant aux conditions initiales de la méthode est requise.

Si le rééquilibrage est trop court, cela peut entraîner des fluctuations du temps de rétention ou, comme montré dans l'exemple ci-dessus, des temps de rétention progressivement plus courts d'une injection à l'autre en raison du solvant fort encore présent dans la colonne. Dans ce cas, la colonne n'est plus en équilibre.

Une grande attention doit être portée à la phase mobile. La colonne et les éluants sont les éléments cruciaux pour une bonne séparation et des mesures stables. Par conséquent, stockez vos éluants dans des flacons appropriées et fermez-les avec des bouchons adaptés. Ne laissez pas les éluants au soleil ou dans le courant direct d'un climatiseur.

Selon la composition de l'éluant, une partie du solvant organique peut rapidement s'évaporer, modifiant ainsi la composition de l'éluant. Dans l'image à droite, vous pouvez voir l'influence de laisser une bouteille d'éluant non scellée contenant un mélange d'eau et d'acétonitrile. Plus l'acétonitrile s'évapore, plus la force d'élution diminue, et plus les temps de rétention sont longs.

Souvent, les problèmes liés aux phases mobiles proviennent d'une mauvaise préparation des éluants. Vous devez développer des procédures précises pour garantir une qualité cohérente des éluants. Un bon exemple est la préparation d'une solution de méthanol à 50 % d'eau. Cette solution peut être préparée de différentes manières, et selon la personne qui la prépare, différents résultats peuvent se produire.

Dans le cas de le préparateur 1, 500 ml d'eau est mélangé avec 500 ml de méthanol. Le résultat est de 0,94 L d'une solution 1/1 en termes de volume. Pour le préparateur 2, 500 ml de méthanol sont placés dans un flacon volumétrique de 1 L et remplis jusqu'à 1 L avec de l'eau. Dans ce cas, vous obtenez 1 L d'une solution de méthanol à 50 % basée sur le volume.

Ces deux solutions ont des forces d'élution différentes, comme le montre l'exemple suivant avec un tampon phosphate et de l'acétonitrile. Les temps de rétention des analytes individuels fluctuent de manière significative et, dans le pire des cas, peuvent tomber en dehors de la fenêtre de temps d'identification.

Pour cette raison, certains utilisateurs choisissent d'acheter des phases mobiles pré-mélangées pour garantir la cohérence de leurs élutions.

En plus des raisons énumérées ici, de nombreuses autres raisons peuvent provoquer des fluctuations du temps de rétention. Celles-ci peuvent inclure une capacité de tampon insuffisante, un mauvais mélange en ligne, une colonne endommagée ou desséchée, ou des contaminants accumulés.

Si vous êtes confronté à des fluctuations du temps de rétention, il est recommandé de vérifier d'abord le contrôle de la température de la colonne, puis de vérifier la pompe et les éluants. Pour un test rapide, remplacez les éluants par de nouvelles et vérifiez les temps de rétention avec vos références/contôles. Utiliser l'instrument pour créer ces types de mélanges garantira une précision maximale.