Changement de forme de pic - Partie 2

Le fronting fait généralement référence à une asymétrie du pic, où un pic est plus raide à la fin qu'au début - semblable à une nageoire de requin. Si le fronting augmente progressivement, dans la plupart des cas, une colonne défectueuse en est la cause. La phase stationnaire peut être endommagée en raison du vieillissement normal ou de l'exploitation de la colonne en dehors des spécifications (par exemple, température ou pH). Dans ce cas, seul le remplacement de la colonne et l'ajustement des conditions chromatographiques aideront.

Cependant, le surchargement de la colonne entraîne également un fronting des pics. Si trop d'échantillon est injecté, tous les sites actifs à la tête de la colonne sont occupés, et l'échantillon restant passe devant les sites occupés avec moins d'interaction. Si vous êtes contraint à des volumes d'injection élevés, une colonne avec un diamètre intérieur plus grand ou une capacité plus élevée peut aider. On parle ainsi de taux de charge de la colonne. 

Une autre raison du fronting des pics peut être un solvant d'échantillon incompatible ou une mauvaise solubilité de l'échantillon avec la phase mobile. Dans ce cas, seul le changement du solvant d'échantillon aidera. Une température de colonne trop basse peut également provoquer un fronting.

Le tailing, avec l'élargissement, est le changement de forme de pic le plus courant et est l'exact opposé du fronting. Le bord montant du pic a une pente plus importante que la fin, souvent causée par le fait que l'analyte a plus d'un mécanisme de rétention sur la colonne.

Lors de l'utilisation d'une colonne en phase inverse standard (RP-HPLC), la rétention de l'analyte est généralement obtenue par des interactions hydrophobes, mais l'interaction des analytes basiques avec les groupes silanol libres (Si–OH) peut entraîner un tailing. Comme les groupes silanol sont acides, il est possible de minimiser les interactions avec l'analyte en abaissant le pH des conditions chromatographiques. Si cela n'est pas possible, essayez de remplacer la colonne par une colonne désactivée, comme une colonne en polymère ou une colonne avec un bon Endcapping (capping des Si–OH résiduels). Certains fabricants de colonnes proposent des colonnes spéciales pour l'analyse de substances fortement basiques.

Une colonne endommagée ou des conditions d'analyse incorrectes, telles qu'une valeur de pH incorrecte de la phase mobile, peuvent également entraîner un tailing, tout comme le fronting.

Dans la section précédente sur les changements de forme de pic, nous avons discuté des réglages du détecteur. Une réponse du détecteur réglée trop haut peut contribuer à l'élargissement des pics. Cependant, il est important de noter que le vieillissement normal de la colonne est également une cause courante.

Si l'élargissement des pics se produit en raison de la dispersion dans la vanne d'injection, une "injection sandwich" avec de petites bulles d'air peut aider à réduire cet effet. Une autre cause de dispersion peut être due à l'utilisation de capillaires avec un diamètre trop grand ou à l'introduction involontaire d'un volume mort en raison de connexions mal serrées.

Regardez ce qui se passe dans le chromatographe ci-dessous lorsque l'on utilise un capillaire de 0,5 mm de diamètre intérieur au lieu d'un capillaire de 0,125 mm - la séparation de la ligne de base est perdue et les pics se sont élargis. Cependant, vous devez également noter que des capillaires plus étroits peuvent générer des pressions de retour plus élevées dans le système. Par conséquent, ajustez les dimensions des capillaires à votre système chromatographique afin de ne pas atteindre les limites des pressions maximales admissibles.

Si le volume mort du système est augmenté, l'élargissement des pics est une occurrence courante qui affecte davantage les temps de rétention plus précoces que les plus tardifs.  Vérifiez toutes les connexions pour vous assurer qu'aucun volume mort supplémentaire n'a été introduit, comme entre la tête de colonne et le capillaire. Cela est particulièrement important à vérifier après le changement d'une colonne.

Dans les mesures isocratiques, l'élargissement des pics se produit naturellement en raison de la diffusion longitudinale à l'intérieur de la colonne et est donc inévitable. Cela affecte principalement les pics qui s'éluent plus tard. Passer à une méthode en gradient peut aider à atténuer ce problème.

La température joue également un rôle significatif dans l'élargissement des pics. Les gradients de température à l'intérieur de la colonne doivent être évités car ils favorisent l'élargissement. Pour minimiser cela, utilisez toujours un four à colonne et assurez-vous que la phase mobile est préchauffée (lorsque cela est possible). Sans préchauffage, même une colonne à température contrôlée peut connaître des gradients de température internes, entraînant un élargissement des pics, comme le montre l'image ci-dessous.