Changements de forme de pic - Partie 1
Cours de troubleshooting HPLC
1 - Notions de base du troubleshooting
2 - Mesures de maintenance préventive
3 - Perturbations de la ligne de base
5 - Changements de forme de pic - Partie 1
6 - Changements de forme de pic - Partie 2
7 - Pics fantômes
8 - Fluctuations des surfaces des pics
9 - Fluctuations du temps de rétention - Partie 1
10 - Fluctuations du temps de rétention - Partie 2
11 - Durée de vie de la colonne - Partie 1
12 - Durée de vie de la colonne - Partie 2
13 - Problèmes de détecteur
14 - Fuites dans la ligne de flux
15 - Résumé du cours
Obtenir une bonne forme de pic est essentiel pour une chromatographie efficace. Étant donné la variété des causes possibles, ce sujet est divisé en deux parties. La première partie explore l'impact de l'injection et de l'acquisition de données sur la forme des pics. La deuxième partie examine les raisons potentielles derrière les variations des formes de pics.
1. Effet du solvant d'échantillon
Le solvant d'échantillon doit généralement correspondre aux conditions de départ de la méthode chromatographique. Cela minimise l'impact du solvant d'échantillon sur l'analyse. Cependant, l'utilisation d'un solvant plus faible - comme l'eau en chromatographie en phase inversée - peut être bénéfique, car elle concentre les analytes à la tête de la colonne, améliorant ainsi la netteté des pics.
Si le solvant d'échantillon a une force d'élution très élevée, comme 100 % de méthanol, l'analyte peut être "traîné" par le solvant d'échantillon. Cela entraîne des pics élargis ou même la formation de pics doubles.
Si l'échantillon ne peut pas être dissous dans un solvant plus favorable, une co-injection avec de l'eau, connue sous le nom d'injection "sandwich", peut être employée. Cela consiste à programmer le passeur d'échantillons pour aspirer un volume d'eau, puis l'échantillon, puis de l'eau à nouveau, afin de créer un échantillon concentré à la tête de la colonne, annulant ainsi les effets indésirables d'élargissement de bande.
2. Impact du volume d'injection
Un volume d'injection excessif peut également entraîner des formes de pics déformées. Lorsque la quantité d'analyte injectée est constante mais que le volume d'injection varie, comme illustré dans la figure suivante, les formes de pics résultantes peuvent différer significativement.
La solution à ce problème dépend largement de la méthode chromatographique et de la préparation de l'échantillon. Les approches potentielles incluent :
- Réduire le volume d'injection si la limite de détection le permet
- Concentrer l'échantillon pour permettre un plus petit volume d'injection
- Sélectionner une colonne différente pour mieux convenir à l'analyse
3. Fréquence d'acquisition de données
Un facteur souvent négligé en chromatographie est la fréquence d'acquisition de données, qui impacte significativement la qualité du chromatogramme. Il est essentiel d'ajuster la fréquence d'acquisition pour convenir à la méthode chromatographique spécifique. Cet ajustement affecte non seulement l'apparence du chromatogramme mais aussi l'exactitude des données.
À première vue, les pics dans la première image peuvent sembler presque identiques, malgré des mesures avec différent fréquence d'acquisition de données. Cependant, lorsque les chromatogrammes sont superposés et que la section est agrandie, comme montré dans la deuxième image, les différences deviennent évidentes.
Les pics mesurés avec une faible fréquence d'acquisition sont mal tracés en raison d'un nombre insuffisant de points de données. Cela peut entraîner des fluctuations significatives de la surface des pics, car de légères variations peuvent empêcher le tracé du vrai maximum du pic. Inversement, un taux d'acquisition de données excessivement élevé peut également avoir des inconvénients, tels que des niveaux de bruit accrus, ce qui peut obscurcir les petits pics ou réduire la clarté globale du signal.
Un autre paramètre est le réglage de la réponse du détecteur. Si la réponse est réglée trop haut, les pics sont artificiellement élargis, réduisant la résolution. En revanche, un réglage trop bas de la réponse rétrécit les pics mais amplifie le bruit.
Malheureusement, il n'existe pas de valeurs standard pour la fréquence d'acquisition de données et la réponse d'un détecteur. Ils doivent toujours être adaptés à la méthode chromatographique respective. En règle générale, il doit être aussi rapide que possible tout en maintenant un rapport signal/bruit acceptable.
Choses à considérer quotidiennement :
- Considérez les paramètres du détecteur lors du développement de la méthode !
- Évitez d'utiliser des solvants d'échantillon avec une forte force d'élution
- Limitez les volumes d'injection pour éviter de surcharger la colonne et maintenir des formes de pics cohérentes
Dans la prochaine partie, nous aborderons divers effets tels que le front et la traîne.
Votre équipe Shimadzu LC