Méthodes de séparation des sucres
Les sucres sont l'un des types de composés organiques les plus répandus et les plus abondants dans le monde naturel. Une variété de types de sucre sont disponibles, tels que les monosaccharides, les oligosaccharides, les polysaccharides, les sucres neutres, les sucres acides, les sucres aminés, les alcools de sucre et leurs divers isomères. Les systèmes HPLC sont couramment utilisés pour séparer et analyser ces sucres. Une sélection minutieuse d'une méthode de séparation et d'une méthode de détection appropriées est requise en fonction des objectifs. Cette page discute de ces méthodes de séparation (principalement pour les sucres neutres).
Types de Méthodes de Séparation
Il existe cinq modes représentatifs utilisés pour séparer les sucres, comme décrit ci-dessous. Chaque mode est utilisé pour séparer les sucres en fonction de différents mécanismes.
- ■ Exclusion par Taille : Taille des molécules
■ Conversion de Ligand : Tendance à former des complexes avec des contre-ions métalliques
■ Partition (phase normale) : Tendance à se partitionner dans les phases stationnaires (ou phases aqueuses)
■ Échange d'Anions : Tendance à échanger des anions
■ Échange d'Anions par Complexe Borate : Tendance d'un complexe avec le borate à échanger des anions
(Cependant, dans certains cas, plus d'un de ces modes peuvent être utilisés.)
Exclusion par Taille
Cette méthode est utilisée pour séparer les sucres en fonction du poids moléculaire. Elle fournit une distribution des poids moléculaires allant de plusieurs centaines à plusieurs millions. Essentiellement, la séparation est basée sur la taille des molécules, donc les composants ayant le même poids moléculaire ne peuvent pas être séparés.
Un polymère hydrophile est utilisé pour le matériau de garnissage, et seule de l'eau est généralement utilisée comme phase mobile. Cependant, un sel est parfois ajouté à la phase mobile pour les composants ioniques ou autres, qui peuvent interagir avec le matériau de garnissage.
Conversion de Ligand
Cette méthode utilise un gel de polystyrène sulfoné avec un contre-ion métallique, tel que le sodium (type Na), le calcium (type Ca) ou le plomb (type Pb), comme matériau de garnissage et est principalement adaptée pour séparer les sucres jusqu'aux disaccharides. La rétention des sucres utilisant cette méthode est principalement basée sur la formation de complexes entre les groupes hydroxyle des sucres et les contre-ions métalliques. Par conséquent, la rétention varie en fonction de la stabilité des complexes créés en échangeant les sucres avec l'eau d'hydratation des contre-ions métalliques. À la base de la séparation se trouve la méthode d'exclusion par taille, qui a une limite d'exclusion de poids moléculaire d'environ 1000, mais la rétention peut différer même pour les monosaccharides de même poids moléculaire, en fonction du type de contre-ion métallique ou de la position ou du nombre de groupes hydroxyle dans le sucre.
Avec le type Na, la plupart des séparations sont causées par l'exclusion par taille (seuls le glucose et le fructose peuvent être séparés, par exemple). Avec le type Ca, les alcools de sucre sont sélectivement retenus, tandis que la rétention des alcools de sucre devient plus forte et la séparation mutuelle de certains monosaccharides devient également meilleure avec le type Pb.
Comme seule de l'eau est utilisée comme phase mobile, cette méthode est respectueuse de l'environnement. D'autre part, cependant, la phase mobile ne peut pas être utilisée pour contrôler la séparation.
De plus, il est difficile de séparer mutuellement les disaccharides en utilisant cette méthode. Avec le type Ca ou Pb, il faut faire attention à régler la température de la colonne à 80 °C (pour éviter que les pics ne se divisent ou ne se déforment en raison de la séparation anomère).
Partition (phase normale)
Cette méthode est adaptée pour séparer les sucres allant des monosaccharides aux oligosaccharides. En particulier, parce qu'elle permet de distinguer les différences entre les sucres constitutifs individuels dans les oligosaccharides, elle peut être utilisée pour séparer facilement deux types de sucres.
Typiquement, un matériau de garnissage d'aminopropyle lié à un support de polymère de silice est utilisé pour la méthode de partition. Un mélange d'acétonitrile et d'eau est utilisé comme phase mobile, où plus le ratio d'eau est élevé, plus l'élution est rapide. De plus, plus le poids moléculaire du sucre est élevé, plus il faut de temps pour éluer.
Dans cette méthode, la rétention du sucre est pensée pour être due à la partition des sucres à partir de l'eau qui est "condensée" dans la phase stationnaire. Cependant, les radicaux aldéhyde dans les sucres peuvent réagir avec les radicaux aminés dans la phase stationnaire pour créer des bases de Schiff, ce qui peut parfois provoquer une traînée significative sur les pics pour les pentoses (tels que l'arabinose et le ribose) en particulier. Cela peut être inhibé en ajoutant un sel à la phase mobile. Notez également qu'il y a une limite à la quantité de monosaccharides qui peuvent être séparés.
Échange d'Anions
Comme la valeur de pKa pour les sucres neutres est d'environ 12, les sucres neutres peuvent être retenus dans un polymère échangeur d'anions si des phases mobiles fortement basiques sont utilisées. Dans de tels cas, une solution d'hydroxyde de sodium d'environ 0,1 M est utilisée comme phase mobile.
En général, les sucres élueront dans l'ordre des monosaccharides aux oligosaccharides. Lorsqu'elle est combinée avec une méthode de gradient qui varie la concentration d'hydroxyde de sodium, plusieurs composants peuvent être séparés en même temps.
Échange d'Anions par Complexe Borate
Les sucres et autres composés polyoxydes réagissent rapidement avec le borate ou les sels de borate pour former des complexes chargés négativement. En d'autres termes, les sucres peuvent être séparés par échange d'anions en utilisant une solution tampon de borate comme phase mobile.
Cette méthode est particulièrement efficace pour séparer les disaccharides des monosaccharides. En particulier, l'utilisation d'une méthode de gradient qui varie la concentration et le pH de la solution tampon de borate permet de séparer plusieurs composants de manière efficace.
Comme décrit ci-dessus, séparer les sucres peut être assez difficile. Les composants cibles et les contaminants doivent être soigneusement pris en compte pour sélectionner la méthode optimale. La référence technique suivante est disponible comme référence pour analyser les sucres.
(Mk)
