Méthodes de détection (1)
Dans la page précédente, nous avons décrit les méthodes de séparation des sucres. Ici, nous allons discuter des méthodes de détection des sucres (principalement des sucres neutres).
Types de Méthodes de Détection
Lors du choix d'une méthode de détection pour une substance donnée, nous vérifierions généralement d'abord la structure de cette substance. Cependant, en ce qui concerne la structure du sucre, la seule structure fonctionnelle notable est le groupe hydroxyle, alors comment doivent-ils être détectés ? Les principales méthodes disponibles pour détecter les sucres en utilisant la HPLC sont listées ci-dessous.
- ■ Détection UV-Vis Directement (190 à 195 nm) ou dérivé (pré-colonne et post-colonne)
■ Indice de Réfraction
■ Détection de Fluorescence ; Dérivé (pré-colonne et post-colonne)
■ Détection Électrochimique ; Électrode Cu ou Électrode Au
■ Détection de Diffusion de la Lumière Évaporative
Chaque méthode est brièvement décrite ci-dessous :
Détection UV-Visible
L'absorption UV pour les sucres ne peut être détectée qu'à proximité de 190 à 195 nm. Par conséquent, étant donné que la détection directe de l'absorption UV est limitée à cette plage de faible longueur d'onde, elle doit être considérée comme impraticable à moins que seule de l'eau soit utilisée comme phase mobile et que l'échantillon soit relativement non contaminé.
Pour permettre la détection UV-visible, dans le passé, une réaction colorée, telle que la méthode orcinol-acide sulfurique, était utilisée comme méthode de dérivation post-colonne. Cependant, cela n'est plus utilisé, car cela nécessite un instrument résistant à la corrosion et est difficile à manipuler. Aucune méthode de pré-colonne n'est non plus utilisée de manière pratique.
Détection par Indice de Réfraction
La détection par indice de réfraction est une méthode de détection à usage général qui peut détecter presque tous les composants d'échantillon ayant un indice de réfraction différent de celui de la phase mobile. C'est la méthode de détection standard largement utilisée pour analyser les sucres. Dans le passé, la sensibilité de détection n'était pas très bonne, mais les performances des instruments se sont améliorées ces dernières années et peuvent maintenant détecter les sucres dans une phase mobile aqueuse jusqu'au niveau nanomolaire. Cependant, même si c'est une méthode de détection à usage général, la sélectivité de détection est médiocre.
Étant donné qu'elle ne permet pas les méthodes d'élution en gradient, elle n'est pas utile pour analyser les oligosaccharides en utilisant la méthode de partition ou pour l'analyse multi-analytes en utilisant la méthode d'échange d'anions par complexe borate.
De plus, elle peut provoquer des ondulations de la ligne de base lors d'une analyse à haute sensibilité utilisant la méthode de partition. On pense que cela est causé par de légères variations de la phase mobile (mélange acétonitrile/eau) à l'équilibre qui se produisent près de la surface de la phase stationnaire, en raison de légères variations de température, qui sont détectées par le détecteur comme des variations de l'indice de réfraction.
Notez également que lors de l'utilisation de la méthode d'échange d'anions par complexe borate, des pics fantômes de l'acide borique (pics de système) peuvent apparaître comme des pics de sucre.
Détection de Fluorescence
La détection de fluorescence offre une sensibilité et une sélectivité de détection bien supérieures, mais elle nécessite que les composants émettent de la fluorescence. Comme les sucres ne sont pas fluorescents, diverses méthodes de dérivation sont étudiées.
La dérivation pyridylamino, qui utilise la 2-aminopyridine comme réactif pour la dérivation pyridine amino, est une méthode de pré-colonne largement utilisée pour l'analyse structurelle des chaînes de sucre dans les glycoprotéines et permet la détection jusqu'au niveau picomolaire. Cependant, le processus de prétraitement pour la dérivation nécessite un temps considérable.
En revanche, les méthodes post-colonne sont préférées pour l'analyse de routine car elles permettent d'automatiser la réaction de dérivation. De nombreuses méthodes post-colonne ont été développées dans les années 1980, telles que les méthodes utilisant la 2-cyanoacétamide et l'éthanolamine. Au cours de la même période, Shimadzu a découvert que l'arginine, qui est un acide aminé basique, génère des dérivés fortement fluorescents dans une réaction thermique avec le sucre en présence d'acide borique, et a construit un système analytique basé sur ce principe. Ces systèmes sont encore utilisés par de nombreux clients aujourd'hui.
Détection Électrochimique
La détection électrochimique est également une méthode de détection hautement sensible. Dans le cas des sucres, elle comprend des méthodes utilisant soit des électrodes en cuivre, soit des électrodes en or. En particulier, la combinaison d'une électrode Au avec un mode à impulsions permet de détecter les sucres jusqu'à plusieurs picomoles.
Cependant, dans cette méthode, la solution de réaction doit être maintenue dans un état fortement alcalin. En fonction des conditions de la phase mobile, cela nécessite l'utilisation d'une pompe séparée pour ajouter de l'hydroxyde de sodium concentré à l'éluat de la colonne. De plus, la sélectivité de détection n'est pas très élevée, ce qui peut dans certains cas poser des problèmes pour séparer les composants cibles des contaminants.
Détecteur de Diffusion de la Lumière Évaporative
Les détecteurs de diffusion de la lumière évaporative sont des détecteurs à usage général qui peuvent détecter toute substance non volatile en pulvérisant l'éluat de la colonne pour éliminer la phase mobile par évaporation, puis en irradiant le soluté avec de la lumière et en détectant la lumière diffusée. Les systèmes ELSD commerciaux sont disponibles depuis environ 20 ans, mais n'ont pas été largement adoptés au début en raison de problèmes de sensibilité et d'opérabilité.
Cependant, plus récemment, avec l'apparition de modèles aux performances améliorées (tels que l'ELSD-LTII, par exemple), ils sont maintenant réévalués en tant que détecteurs à usage général. En termes de détection des sucres, ils sont utiles pour analyser les oligosaccharides en utilisant la méthode de partition en particulier, car ils permettent l'utilisation de l'élution en gradient. Cependant, en raison de leur principe de détection, notez que ces détecteurs ne permettent pas l'utilisation de phases mobiles non volatiles (telles que les solutions tampons).
Par conséquent, comme décrit ci-dessus, il existe de nombreux choix pour analyser les sucres, non seulement en termes de méthodes de séparation, mais aussi de méthodes de détection. Veuillez sélectionner la combinaison optimale pour vos objectifs.
