Méthodes de détection (2)

Les méthodes de séparation des sucres ont été discutées dans LCtalk 49 et les méthodes de détection ont été discutées dans LCtalk 50. En réponse à une demande d'un lecteur, cette page décrit la méthode de détection par fluorescence post-colonne plus en détail. Par conséquent, nous continuerons notre discussion sur les méthodes de détection en nous concentrant spécifiquement sur la méthode de détection par fluorescence post-colonne, en utilisant l'arginine comme réactif.

Quand la Méthode de Fluorescence Post-Colonne est-elle Nécessaire ?

Comme mentionné dans LCtalk 50, il existe plusieurs choix pour détecter les sucres. En termes très approximatifs, si la concentration de l'échantillon est suffisante pour avoir un goût sucré, envisagez un détecteur d'indice de réfraction comme premier candidat. Les détecteurs d'indice de réfraction sont largement utilisés dans l'industrie alimentaire.
Cependant, même s'il s'agit d'aliments, qu'en est-il des aliments fermentés comme la sauce soja ?

Le sucre typique dans la sauce soja est le glucose, qui peut être détecté en utilisant un détecteur d'indice de réfraction, mais il est présumé que ceux qui analysent la sauce soja sont plus intéressés par les autres sucres non-glucose (tels que le ribose, le mannose, l'arabinose, le galactose et le xylose). Si c'est le cas, alors cela ne peut plus être traité avec un détecteur d'indice de réfraction. En termes de sensibilité, un détecteur électrochimique pourrait être envisagé, mais la sauce soja contient de grandes quantités d'acides aminés, ce qui pourrait interférer avec l'analyse. Dans de tels cas, la méthode de fluorescence post-colonne est requise.

Qu'est-ce que la Méthode Post-Colonne Utilisant le Réactif Arginine ?

Fig. 1 Schéma de la Ligne de Flux du Système HPLC avec Détection par Fluorescence Post-Colonne

Shimadzu a découvert que le sucre réducteur génère des dérivés fortement fluorescents (longueur d'onde d'excitation 340 nm et longueur d'onde de fluorescence 430 nm) lorsqu'il réagit avec l'arginine, un acide aminé basique, en présence d'acide borique dans une réaction thermique (150 °C)¹⁾. Par conséquent, Shimadzu a construit un système HPLC avec détection par fluorescence post-colonne basé sur l'application de ce processus de réaction. La Figure 1 montre un schéma de la ligne de flux du système.
Cette méthode peut être utilisée avec chaque méthode de séparation des sucres décrite dans LCtalk 49, mais elle est la plus efficace lorsqu'elle est combinée avec la méthode d'échange d'anions par complexe borate. La méthode d'échange d'anions par complexe borate offre une séparation supérieure des disaccharides des monosaccharides. Pour améliorer l'efficacité de la séparation, cependant, une élution en gradient est nécessaire, ce qui exclut l'utilisation d'un détecteur d'indice de réfraction. Cette détection par fluorescence post-colonne utilisant le réactif arginine combinée à la méthode d'échange d'anions par complexe borate est actuellement encore largement utilisée.

Quels sont les Avantages du Réactif Arginine ?

Il existe plusieurs façons possibles de réaliser la détection par fluorescence post-colonne du sucre réducteur, mais les plus grands avantages de l'utilisation du réactif arginine sont sans aucun doute sa disponibilité facile, son prix raisonnable et sa sécurité supérieure.

De plus, la méthode à l'arginine permet la détection du saccharose, qui est un disaccharide non réducteur. Bien que la sensibilité de détection ne soit qu'un dixième de celle du disaccharide réducteur, le maltose, le fait qu'elle puisse détecter le saccharose est un avantage significatif.

En Savoir Plus sur le Réactif Arginine

Plus tard, Shimadzu a étudié comment ajouter le réactif arginine à la phase mobile à l'avance. Cette méthode a permis d'augmenter l'efficacité de la réaction car elle ne nécessitait pas de mélangeur ou de pompe de distribution de réactif de réaction. Nous avons également pensé que cela permettrait de simplifier l'instrument.

Sur la base de nos résultats d'étude, nous avons déterminé que l'arginine dans la phase mobile n'avait aucun effet sur la séparation des sucres en utilisant la méthode d'échange d'anions par complexe borate et réagissait efficacement lorsqu'elle était chauffée à 150 °C dans la bobine de réaction.

Qu'en est-il de l'Analyse de la Sauce Soja ?

Fig. 2 Résultats de l'Analyse de la Sauce Soja

Enfin, revenons à notre question précédente sur l'analyse des sucres dans la sauce soja, examinons les résultats analytiques en utilisant ce système. La Figure 2 montre les résultats analytiques pour un produit de sauce soja commercialisé. Elle montre que de faibles quantités de sucres non-glucose sont détectées.

1) H.Mikami et Y.Ishida : Bunseki Kagaku, 32, E207 (1983).
2) H.Mikami et Y.Ishida : 10th International Symposium on Column Liquid Chromatography (1986).