Analyse de la composition des monosaccharides
Comme les chaînes de sucres dans les glycoprotéines telles que les anticorps sont ajoutées par les actions de plusieurs enzymes après la traduction des protéines, la diversité et la non-uniformité de la structure de la chaîne de sucres constituent un problème inévitable. Les lignes directrices exigent la détermination de la teneur en sucres (sucres neutres, sucres aminés, acide sialique). Un détecteur d’indice de réfraction différentiel est généralement utilisé pour l’analyse de la composition des saccharides. Cependant, la détection par fluorescence est utilisée pour l’analyse de la composition en saccharides des médicaments à base d’anticorps, car elle offre une sensibilité plus élevée. Les sucres eux-mêmes n'étant pas fluorescents, ils subissent une dérivatisation par une méthode appropriée pour les rendre fluorescents avant analyse par un chromatographe liquide haute performance équipé d'un détecteur de fluorescence.
Analyse des anticorps monoclonaux de souris de laboratoire
Flux d'expérimentation et de recherche
- Effectuer une digestion enzymatique (neuraminidase, etc.), une hydrolyse et une N-acétylation sur les anticorps monoclonaux de souris.
- Appliquer des marqueurs fluorescents à l’extrémité réductrice des monosaccharides libres à l’aide de l’ester éthylique de l’acide 4-aminobenzoïque (ABEE).
- Effectuer une analyse LC des monosaccharides marqués fluorescents à l’aide de Prominence.
* Utilisez le kit d'analyse de composition de monosaccharides Plus S ABEE (fabriqué par J-OIL MILLS, Inc., Japon) pour le prétraitement des anticorps monoclonaux de souris.
Resultats
Un échantillon standard comprenant un mélange de six monosaccharides avec des marqueurs fluorescents a été analysé à l'aide de Prominence, et la courbe d'étalonnage pour chaque monosaccharide a été déterminée à partir des valeurs de surface (Fig. 1 et Fig. 2).
Ensuite, un dixième du mélange de monosaccharides obtenu en traitant 60 µg (400 pmol) d'anticorps monoclonal de souris a été analysé à l'aide d'un système Prominence et la surface de chaque pic de monosaccharide a été calculée (Fig. 3).
La quantité de chaque monosaccharide contenue dans 1 mole d'anticorps monoclonal a ensuite été calculée à partir des surfaces calculées des pics de monosaccharide, en utilisant la courbe d'étalonnage obtenue à partir de l'échantillon standard.
Le tableau 1 répertorie la quantité de chaque monosaccharide contenue pour 1 mole d'anticorps monoclonal de souris commercial utilisé pour ce test.
