Analyse des nucléotides

La caractérisation moléculaire des acides nucléiques à l'aide de la spectrométrie de masse suscite actuellement un intérêt croissant, car les oligonucléotides thérapeutiques sont un médicament prometteur pour guérir certaines maladies en agissant sur le mécanisme d'action supérieur avec moins d'effets secondaires. Alors qu’un spectromètre de masse ESI précis à haute résolution permet une mesure exacte de la masse intacte, l’analyse de routine des oligo-séquences reste un obstacle à l’aide des instruments ESI. La séquence oligo interne complète est rarement obtenue en utilisant la technique ESI-MS/MS typique. D'autre part, la désintégration à la source (ISD) utilisant MALDI-TOF MS a été signalée comme une méthode utile pour effectuer une analyse de séquence, bien que les instruments souvent utilisés n'aient pas de spécifications suffisantes pour une mesure exacte de la masse. Nous rapportons ici la caractérisation des produits thérapeutiques oligonucléotidiques à l’aide d’ESI-QTOF, du LCMS-9030 et d’un MALDI-TOFMS linéaire de paillasse à double polarité, le MALDI-8030.

Les oligonucléotides synthétiques sont de courtes séquences d'ADN ou d'ARN qui trouvent différentes applications en biologie moléculaire, comme les amorces utilisées dans le séquençage de l'ADN et l'amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Récemment, des oligonucléotides synthétiques ont également été explorés à des fins thérapeutiques et diagnostiques, ainsi que des kits de tests de diagnostic basés sur l'ADN, dans plusieurs conditions. La fibrose kystique est un exemple de maladie qui se développe au niveau de l'ADN. Il s'agit de la maladie autosomique récessive la plus courante chez les Caucasiens et elle est causée par une mutation du gène du régulateur de conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR), situé sur la région chromosomique 7q31.2 et contenant 27 exons.

Les oligonucléotides thérapeutiques sont des oligonucléotides synthétiques qui démontrent leur efficacité médicale en se liant à des gènes cibles ou à des protéines cibles pouvant être responsables de diverses maladies. À ce jour, huit types d’oligonucléotides thérapeutiques ont été approuvés, dont beaucoup ont une longueur d’environ 20 bases. Comme l'oligonucléotide thérapeutique, l'oligonucléotide modifié par 2'-MOE ayant 20 bases a été utilisé.

Les thérapies oligonucléotidiques ont attiré l'attention ces dernières années en tant que nouvelle modalité de découverte de médicaments, car elles peuvent être utilisées pour créer des agents thérapeutiques spécifiques à une maladie et peuvent être facilement conçues par synthèse chimique. Typiquement, ils sont composés d'oligonucléotides comportant environ une douzaine à plusieurs dizaines de bases (y compris des bases modifiées). Le contrôle qualité nécessite l'analyse des impuretés, telles que les sous-produits, les résidus n'ayant pas réagi et les produits de dégradation, en plus des composants principaux. La HPLC-UV est couramment utilisée pour la confirmation de la pureté, mais si des impuretés sont détectées, elles doivent être vérifiées pour confirmer s'il s'agit d'impuretés connues ou non.

Les médicaments à base d'acide nucléique, tels que les oligonucléotides antisens, exercent leur effet en interagissant avec des cibles (gènes et protéines) à l'intérieur et à l'extérieur des cellules. Les médicaments à base d'acide nucléique sont produits par synthèse chimique, mais le processus de synthèse peut introduire des impuretés telles que des produits et des groupes de protection de plus en plus longs. Une séparation appropriée de l'oligonucléotide cible est nécessaire. Pour la séparation LC, un mode couramment utilisé est la chromatographie par paires d'ions en phase inversée (RP-IP). 

Cet article décrit comment réaliser efficacement la séparation optimale des oligonucléotides et des impuretés associées en utilisant LabSolutions MD, un logiciel dédié pour soutenir le développement de méthodes, respectivement via la phase de criblage initial et d'optimisation.

Les médicaments à base d'acide nucléique sont des oligonucléotides synthétiques conçus pour se lier spécifiquement à l'ARN ou aux protéines cibles. Bien que la plupart des médicaments à base d'acide nucléique approuvés à ce jour soient du type antisens, le type aptamère et le type siARN ont également été approuvés. De nombreux médicaments à base d'acide nucléique sont constitués d'environ 20 bases et ont un poids moléculaire de l'ordre de 6 000. Des techniques d’analyse de masse de précision telles que la LC/MS de type MALDI-TOF et la LC/MS de type Q-TOF sont utilisées pour mesurer le poids moléculaire des substances médicamenteuses. D'autre part, le spectromètre de masse triple quadripôle est généralement utilisé dans les analyses quantitatives telles que l'analyse du devenir des médicaments dans le sang, car cet instrument offre une sensibilité élevée en combinaison avec une large plage dynamique.

Les médicaments à base d'acide nucléique, tels que les oligonucléotides antisens, exercent leur efficacité en interagissant avec des gènes cibles à l'intérieur et à l'extérieur des cellules. Contrairement aux médicaments conventionnels à petites molécules, ils sont capables de cibler les causes des maladies au niveau génétique et attirent l’attention en tant que médicament de nouvelle génération. Les médicaments à base d'acide nucléique sont principalement produits par synthèse chimique, mais le processus de synthèse produit également de nombreuses impuretés telles que des composants de plus courte longueur et des groupes protecteurs. Une séparation et une purification appropriées de l'oligonucléotide cible sont donc nécessaires.

Les sondes ADN marquées avec un colorant fluorescent (appelées ci-dessous sondes fluorescentes) sont largement utilisées pour détecter et identifier un ADN spécifique lors de la réalisation d'études en sciences de la vie. Le mécanisme implique la liaison sélective de la sonde à un ADN spécifique, permettant ainsi la détection de cet ADN. Cependant, en raison de la grande variété de colorants fluorescents, il est important de connaître la longueur d’onde exacte à laquelle la sonde émet une fluorescence pour garantir la détection de l’ADN. Ici, en utilisant la fonction de mesure spectrale tridimensionnelle du spectrofluorophotomètre RF-6000, nous introduisons des exemples de mesure de fluorescence de deux types de sondes fluorescentes.

Le Shimadzu BioSpec-nano est un spectrophotomètre à microvolume nécessitant peu d'entretien conçu pour le laboratoire moderne des sciences de la vie. Il offre des limites de détection supérieures, jusqu'à 10 fois supérieures à celles de la concurrence, ce qui en fait l'instrument idéal pour la quantification de l'ADN, de l'ARN, l'analyse des protéines et les mesures photométriques. La conception « Drop and Click », combinée à un montage facile des échantillons et à un nettoyage automatisé, offre un temps d'analyse rapide de 3 secondes et un temps de cycle de 10 secondes entre les échantillons.