Protéines intactes
| CQAs observables au niveau des protéines intactes | Méthode analytique |
|---|---|
| Agrégation, dimérisation | Chromatographie d'exclusion de taille (SEC) |
| Désamidation, pyroglutamination | Analyse des variantes de charge (IEX) |
| Brouillage des liaisons de disulfure | Mesure du poids moléculaire (LC-MS) |
| Glycoformes majeures | |
| Conjugation médicamenteuse | Chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC) |
Une mesure précise de la masse permet de déterminer si la séquence protéique correcte a été exprimée avec les modifications post-traductionnelles (PTM) attendues. Il fournit également une abondance relative de différentes protéines ou PTM présentes dans le même échantillon. Un spectromètre de masse haute résolution et haute sensibilité facilitera cette analyse. Shimadzu offre la meilleure solution pour une analyse de masse précise à haute résolution de routine avec le LCMS-9030, spectromètre de masse quadripolaire à temps de vol (Q-TOF LC-MS). Il maintient sa précision de masse pendant des jours sans nécessiter de réétalonnage ni utiliser d'étalon interne.
LCMS-9030 Q-TOF LC/MS
AAnalyse d'agrégats et de fragments
Il est connu que les agrégats de protéines induisent fortement des réponses immunogènes lorsqu'ils sont administrés, et l'agrégation est l'un des attributs de qualité les plus importants qui doivent être surveillés et gérés à chaque étape du développement et du raffinement du processus. Par exemple, au stade initial du développement, les lignées cellulaires qui ont une plus grande tendance à produire des agrégats ou des substances dégradantes sont éliminées même si elles présentent un rendement de sécrétion élevé. La chromatographie d'exclusion de taille (SEC) est la méthode de choix pour séparer la fraction monomère majeure des variantes de taille se produisant soit par agrégation, soit par dégradation. Shimadzu fournit une gamme de colonnes SEC particulièrement utiles pour augmenter le débit nécessaire à l'analyse de criblage.
Chromatographie d'exclusion de taille de mAb
Colonne : shim-Pack Bio Diol-300
Débit : 0,2 mL/min
Échantillon : IgG1 monoclonale humanisée
Ici, les chromatogrammes comparent le profil de séparation SEC des mAb acquis par des colonnes Shim-pack Bio Diol-300 de différentes dimensions à un débit constant. La réduction de la taille des particules (5 μm à 2 μm) a entraîné une augmentation de la résolution des pics, ce qui a permis de réduire le temps d'analyse en utilisant une colonne plus courte (30 minutes à 15 minutes).
| Colonne | N (3) | Rs (1,2) | Rs (2,3) |
|---|---|---|---|
| (1) 5μm, 300×4.6mm | 8,500 | 0.88 | 2.67 |
| (2) 2μm, 300×4.6mm | 16,200 | 1.17 | 4.15 |
| (3) 2μm, 150×4.6mm | 8,700 | 0.85 | 2.75 |
Shim-pack Bio Series
Analyse des variantes de charge
La modification, l'isomérisation ou le clivage se produisant sur un résidu d'acide aminé chargé modifie la charge globale de la protéine, affectant sa structure, son affinité de liaison et sa stabilité. L’hétérogénéité liée à la charge est donc un attribut de qualité important du mAb. Le profil des variantes de charge peut être évalué par chromatographie par échange d'ions (IEX), et ceci est surveillé à plusieurs reprises tout au long du flux de travail de développement. La répétabilité du profil d'élution dépend fortement de la robustesse du système HPLC pour maintenir la précision et l'exactitude en présence de sels forts nécessaires pour IEX.
Ici, l’échantillon de mAb a été séparé par chromatographie échangeuse de cations et la répétabilité de 10 injections consécutives a été évaluée. Les résultats présentés démontrent que le système maintient précisément le profil de base et d’élution en présence de NaCl 0,2 M.
Chromatographie échangeuse de cations de mAb
Système HPLC : Prominence-i
Phase mobile : 0,02 M de phosphate de sodium et 0,2 M de NaCl
Débit : 1,0 mL/min
Échantillon : mAb (Trastuzumab)