Analyse des modifications post-traductionnelles | Analyse de la prénylation des protéines synthétiques par spectrométrie de masse

Analyse de la prénylation des protéines synthétiques par spectrométrie de masse

L’importance de l’analyse des modifications post-traductionnelles des protéines s’est accrue ces dernières années.
La prénylation des protéines est une modification lipidique C-terminale, dont beaucoup ont été reconnues dans les protéines de faible poids moléculaire se liant au GTP telles que Ras. Il est connu pour jouer un rôle important dans les interactions protéine-membrane et protéine-protéine.
Une méthode d'analyse efficace pour la prénylation des protéines utilisant une combinaison du kit de synthèse de protéines sans cellules de cellules d'insectes Transdirect et du spectromètre de masse MALDI-TOF est présentée ci-dessous.

Prénylation des protéines :  L'isoprénoïde du groupe farnésyle à 15 carbones ou du groupe géranylgéranyle à 20 carbones est transféré au résidu cystéine près du C-terminal par la prényltransférase. (Voir le schéma ci-dessous.)
La farnésyltransférase (FTase) ou géranylgéranyltransférase I (GGTaseI) reconnaît le motif C-terminal-Cys-Ali-Ali-COOH (où Ali est un acide aminé aliphatique) et transfère le groupe farnésyle ou géranylgéranyle à la cystéine. résidu avec du pyrophosphate de prényle comme donneur.
Nous avons analysé le RhoC d'origine humaine (impliqué dans la transmission du signal) dans lequel la géranylgéranylation est connue pour se produire en tant que protéine modèle.

■ Flux de test

■ Résultats

Non enrichi en pyrophosphate de prényle :
seuls les fragments peptidiques C-terminaux carbamide-méthylés ont été détectés.
Enrichi en FPP : peptide m/z
1 174,75 partiellement farnésylé détecté. Enrichi en GGPP (y compris le mélange matriciel) : peptide géranylgéranylé m/z 1242,83 détecté.

Les résultats ci-dessus montrent que Transdirect retient la prényltransférase qui offre l'activité requise pour la prénylation des protéines. En combinaison avec un spectromètre de masse, on constate que cette méthode constitue un outil puissant pour l’analyse de la prénylation.

Cellule d'insecte transdirecte (Kit de synthèse de protéines sans cellules)

Il s'agit d'un nouveau kit de synthèse de protéines acellulaires dérivé de cultures de cellules d'insectes. Il atteint une capacité de synthèse protéique supérieure à celle d'un système de lasate réticulocytaire de lapin. Le kit est livré avec des tampons de réaction et des vecteurs d’expression optimisés pour permettre de réaliser facilement des tests de synthèse protéique optimaux.

Spectrométrie de masse MALDI-TOF

AXIMA Resonance est un spectromètre de masse MALDI-QIT-TOF qui fournit un support puissant pour la protéomique et l'analyse de la chaîne du sucre.
Il intègre un piège à ions quadripolaire (QIT) pour les mesures MSn d'ordre fmol des ions générés par MALDI.
Ces caractéristiques fournissent des informations structurelles en plus de la masse moléculaire, ce qui rend la MS MALDI-QIT-TOF largement utilisée pour la protéomique, la biochimie, les produits pharmaceutiques, la médecine, la chimie synthétique et l'analyse structurelle des composés organiques.