Acides aminés

Les acides aminés sont les éléments constitutifs des protéines et jouent un rôle important dans le corps humain pour les processus vitaux tels que la formation cellulaire et la synthèse d'hormones et de neurotransmetteurs. Il existe 20 acides aminés différents nécessaires au bon fonctionnement de l’organisme, dont neuf sont essentiels. Ces acides aminés essentiels ne sont pas synthétisés dans l’organisme et doivent être ingérés avec notre alimentation ou au moyen de compléments alimentaires. Les acides aminés, comme toutes les substances nutritionnelles utilisées dans le processus de fabrication des aliments et des boissons, doivent être conformes au règlement (UE) n° 609/2013 de l'UE. Shimadzu propose une solution complète pour l'analyse des acides aminés, comprenant des configurations de système haute sensibilité, un logiciel complet et une prise en charge complète des applications.

La HPLC est la méthode la plus populaire pour analyser les acides aminés présents dans les aliments et les boissons. Comme la détection UV n'offre généralement pas une sensibilité et une sélectivité suffisantes pour leur détection, la procédure la plus courante est la dérivatisation des analytes d'intérêt pour permettre une analyse hautement sensible et sélective utilisant la détection par fluorescence.

La dérivatisation peut avoir lieu avant ou après la séparation, qui présentent toutes deux des avantages et des inconvénients distincts : la méthode idéale dépend de l'analyse cible.

Méthode de dérivatisation pré-colonne (méthode pré-étiquette)

 Lors de l'utilisation d'une méthode de dérivatisation pré-colonne, les acides aminés sont dérivés avant l'injection, les composés marqués sont séparés et détectés. La figure 1 montre un schéma de réactions de dérivatisation d'acides aminés en pré-colonne, utilisant soit du O-phtalaldéhyde (OPA), soit du chloroformiate de 9-fluorénylméthyle (FMOC), qui sont tous deux des réactifs de dérivatisation bien connus qui réagissent rapidement avec les acides aminés à température ambiante.

Figure 1 : Schéma des réactions de dérivatisation des acides aminés pré-colonnes
Haut : Réaction avec le réactif OPA | En bas : réaction avec le réactif FMOC

Les avantages de cette méthode sont une faible consommation de réactif de réaction, une sensibilité accrue lors de l'utilisation de réactifs de qualité qui fournissent des niveaux de fond très faibles et même si un réactif de dérivatisation n'ayant pas réagi est détecté, tant qu'il est séparé des composés cibles dans la colonne, il ne provoque pas un problème dans l'analyse.

D'un autre côté, un inconvénient est que, étant donné que le réactif de dérivatisation est mélangé directement à l'échantillon, l'efficacité de la réaction (rendement) est souvent influencée par la matrice de l'échantillon. Par conséquent, la dérivatisation pré-colonne est la méthode de choix pour l’analyse d’une variété quelque peu limitée d’échantillons avec une sensibilité élevée. Les procédures de dérivatisation avant colonne varient considérablement, du simple mélange à température ambiante aux réactions nécessitant un chauffage ou aux protocoles nécessitant un nettoyage post-réaction. Dans de nombreux cas, la chromatographie en phase inverse est utilisée pour séparer les produits de réaction. Normalement, la chromatographie en phase inverse n'est pas bien adaptée à la séparation de substances hautement hydrophiles telles que les acides aminés. Cependant, comme la dérivatisation pré-colonne dérive les échantillons avant leur introduction dans la colonne, les acides aminés peuvent être modifiés avec des groupes fonctionnels hautement hydrophobes pour permettre la chromatographie en phase inversée. Étant donné que les méthodes en phase inversée offrent une excellente séparation, elles permettent une analyse rapide, comme le montre un exemple de la figure 2. Elle montre un chromatogramme d'analyse de 20 acides aminés protéinogènes sur un système HPLC i-Series utilisant une dérivatisation automatisée en pré-colonne.

Figure 2 : Chromatogramme d’analyse de 20 acides aminés protéinogènes sur un système HPLC i-Series utilisant la dérivatisation automatisée en pré-colonne.

Méthode de dérivatisation post-colonne (méthode de détection de réaction post-colonne)

La méthode de dérivatisation post-colonne consiste à séparer les acides aminés dans la colonne, puis à délivrer et mélanger le réactif de dérivatisation pour le laisser réagir avec les acides aminés, avant d'envoyer enfin les produits au détecteur. Un diagramme de flux d'un processus typique de dérivatisation post-colonne est présenté à la figure 3.

Figure 3 : Diagramme de flux du système d'analyse des acides aminés Nexera utilisant la dérivatisation post-colonne

Les avantages de cette méthode sont d’excellentes performances quantitatives et reproductibilité. Étant donné que les composants de l'échantillon sont séparés avant la réaction, l'efficacité de la réaction est moins sujette aux effets de la matrice de l'échantillon, ce qui permet son utilisation pour une large gamme d'échantillons dans les analyses de routine. En revanche, ses inconvénients incluent la difficulté d'augmenter la sensibilité et la consommation élevée de réactif de réaction, qui est ajouté en débit constant, ne permettant pas la détection du réactif n'ayant pas réagi.

La méthode de séparation la plus couramment utilisée est la chromatographie échangeuse de cations. Les acides aminés sont des zwitterions qui incluent à la fois des groupes amino et carboxyle dans leur structure. Par conséquent, plus l’acidité d’un acide aminé est élevée, plus l’élution est rapide, tandis que plus la basicité d’un acide aminé est élevée, plus l’élution est lente. Par conséquent, la chromatographie échangeuse de cations est capable de séparer facilement et efficacement les acides aminés les uns des autres et des autres amines typiques. La figure 4 montre le chromatogramme de l'analyse des acides aminés dans la poudre de protéine à l'aide du système d'analyse des acides aminés post-colonne Nexera.

Figure 4 : Chromatogramme de l'analyse des acides aminés dans la poudre de protéines à l'aide du système d'analyse des acides aminés post-colonne Nexera

Comparaison des méthodes de dérivatisation pour l'analyse des acides aminés