Pics provenant de l'air dissous dans le solvant de l'échantillon

L'analyse HPLC est souvent gênée par l'apparition de pics d'origine inconnue (pics fantômes). Cela est particulièrement problématique lors des tests d'impuretés des produits pharmaceutiques. Divers facteurs peuvent provoquer des pics fantômes, mais l'une des causes les moins remarquées est la présence d'air dissous dans la solution échantillon. Cette page en discute dans le contexte de la séparation en phase inversée et de la détection UV.

1. Apparition de Pics Probablement Causés par l'Air Dissous (Oxygène)

Si des solvants organiques de types et de compositions différents sont utilisés dans les solutions échantillons et les phases mobiles, il est probable que cela entraîne l'apparition de certains pics. Cependant, dans certains cas, injecter la phase mobile en tant que solution échantillon peut également produire des pics. De plus, si la phase mobile est retenue et élue, on peut se demander quel est ce pic ? Une cause possible est une différence dans la quantité d'air dissous (en particulier la quantité d'oxygène dissous dans le cas de la détection UV).
La Figure 1 montre les résultats de l'injection d'un mélange de phase mobile méthanol/eau directement en tant qu'échantillon, tout en étant dégazé par dégazage en ligne. La concentration d'oxygène dissous a été modifiée et les résultats comparés. Si l'échantillon (phase mobile) est injecté tel quel, en d'autres termes encore saturé d'air, un pic apparaît (voir Figure 1a, où un pic d'environ 10 mAU se produit à partir d'une injection de 10 µL). Ce pic disparaît presque si l'échantillon (phase mobile) est injecté après purge à l'hélium (concentration d'oxygène dissous presque nulle) (Figure 1b). Si purgé avec de l'oxygène (avec une concentration d'oxygène dissous environ 5 fois plus élevée que lorsqu'il est saturé d'air), la taille du pic augmente. (Figure 1c)
Si la phase mobile n'est pas dégazée par dégazage en ligne, le pic n'apparaît pratiquement pas du tout, même si l'échantillon (phase mobile) est injecté saturé d'air (Figure 2a). Si l'échantillon est purgé à l'hélium, un pic négatif est observé (Figure 2b).
Sur la base de ces résultats, le pic apparaît en raison d'une différence dans la quantité d'oxygène dissous dans la phase mobile et la solution échantillon.

2. Taille du Pic

Ensuite, considérons la taille de tels pics. La Figure 3 montre une comparaison des spectres du méthanol saturé d'air (sans dégazage) et du méthanol dégazé. Le dégazage du méthanol réduit l'absorption¹⁾. La différence d'absorption varie en fonction de la longueur d'onde ; l'absorption à 210 nm est supérieure à 300 mAU et à 254 nm est d'environ 10 mAU. Ces valeurs peuvent être utilisées pour effectuer un calcul simple de la hauteur du pic après injection de méthanol saturé d'air dans le méthanol dégazé. Lorsqu'on injecte 10 µL à un débit de 1 mL/min, en supposant un pic triangulaire avec une base de 0,4 minutes de large, la hauteur du pic à 210 nm serait supérieure à 15 mAU et d'environ 0,5 mAU à 254 nm. Pour des longueurs d'onde plus courtes, cela entraîne des pics assez grands.
Qu'en est-il des autres solvants ? La Figure 4 montre les spectres de différence pour divers solvants, calculés en soustrayant les spectres de solvants dégazés des spectres de solvants saturés d'air. Pour chaque solvant, l'absorption augmente en raison de l'air dissous, mais l'air dissous a un effet moindre sur l'eau et l'acétonitrile et un effet plus important sur l'hexane, le méthanol et le THF.
La quantité de changement dans l'absorption ne correspond pas au niveau d'oxygène dissous dans chaque solvant. Par exemple, l'hexane a une solubilité en oxygène beaucoup plus élevée que le méthanol²⁾, mais le changement d'absorption est faible. Par conséquent, la raison de l'absorption n'est pas due à l'absorption par l'oxygène seul. Plutôt, il s'agit vraisemblablement d'une interaction entre l'oxygène et le solvant²⁾.

3. Position d'Élution du Pic

Il peut être tentant de supposer que les pics probablement causés par l'oxygène dissous élueront plus tôt. Cependant, tout comme avec le comportement de rétention des composants échantillons, diminuer le ratio de solvant organique retarde l'élution. La Figure 5 montre un exemple de solution à base de méthanol/eau, où la phase mobile et le solvant échantillon ont la même composition de solvant. Comme indiqué, ces pics peuvent ne pas se séparer des composants cibles. Cette même tendance est observée pour les solutions à base d'acétonitrile/eau ou si l'eau est remplacée par une solution tampon.
Notez que la taille du pic diminue à mesure que le ratio de méthanol est réduit.

4. Comment Vérifier les Pics Supposés Être Causés par l'Air Dissous

Lors de l'utilisation d'une unité de dégazage par membrane de séparation gaz-liquide, si un pic apparaît que vous soupçonnez être dû à l'air dissous, utilisez la méthode suivante pour vérifier le pic. Si l'un des points suivants s'applique, la probabilité est très élevée.

1. Lorsque le solvant échantillon et le volume d'injection sont les mêmes, le pic apparaît à peu près à la même position et de la même taille. Pour saturer la solution échantillon avec de l'air, utilisez un agitateur (ou mélangez en secouant) ou laissez-le dans un système semi-ouvert. Si la solution est diluée pour injecter deux fois le volume, la surface est environ 2 fois plus grande.
2. Le temps d'élution d'un pic qui apparaît lorsque la phase mobile (saturée d'air) est injectée, correspond au temps d'élution du pic suspect. Dans ce cas, si la phase mobile est dégazée (purgée à l'hélium pendant environ 10 secondes) puis injectée, le pic devient plus petit.
3. Lorsque la phase mobile est délivrée sans utiliser d'unité de dégazage et que le solvant échantillon est injecté, le pic devient plus petit. Si la phase mobile saturée d'air est injectée, le pic devient toujours plus petit que dans le cas 2. Si la composition du solvant échantillon est significativement différente de la phase mobile, le pic ne devient pas nécessairement plus petit.

5. Mesures Correctives

Bien qu'il soit difficile d'éliminer complètement les pics causés par l'air dissous, envisageons les méthodes suivantes pour réduire leur taille (en supposant que les conditions analytiques d'origine utilisent une phase mobile à base de méthanol).

1. Changer la phase mobile d'une phase mobile à base de méthanol à une phase mobile à base d'acétonitrile (qualité HPLC). Lors du changement de phase mobile, considérez attentivement la force d'élution et la sélectivité de séparation³⁾.
   → C'est la meilleure méthode si le changement des conditions analytiques est autorisé.
2. Réduire le ratio de méthanol dans la phase mobile. En même temps, sélectionnez une colonne applicable à l'analyse (colonne plus courte avec une rétention plus faible).
   → Cependant, abandonner une colonne ODS sacrifiera une large applicabilité et nécessitera une expertise technique.
3. Arrêter d'utiliser le dégazage en ligne.
   → Arrêter le dégazage en ligne pourrait causer des problèmes de bulles d'air dans les conduites de flux qui pourraient aggraver la précision quantitative ou empêcher d'obtenir une détection stable¹⁾. Par conséquent, ce n'est pas recommandé.
4. Dégazer les solutions échantillons avant l'injection. Un simple dégazage à l'hélium pendant environ 10 secondes entraîne un dégazage significatif.
   → Cependant, le processus ajoute de la complexité/du temps et peut ne pas être efficace pour les opérations continues.

En tant que mesure pour améliorer la séparation des composants cibles,
1) Changer la position d'élution des composants cibles ioniques en modifiant le niveau de pH de la phase mobile.
2) Changer le type de solvant organique.

Ces mesures devraient vraiment être envisagées lors du développement de la méthode.


Comme décrit ci-dessus, même si certains pics fantômes sont jugés être causés par l'air dissous, il peut être difficile de résoudre le problème facilement. Néanmoins, il est extrêmement important pour ceux qui développent et gèrent les conditions analytiques de comprendre les causes.

Informations de Référence :

1) LCtalk Numéro Spécial V, Dégazage des Phases Mobiles (1991)
2) S.R. Bakalyar, M.P.T. Bradley et R. Honganen, J. Chromatogr., pp. 158, 277-293 (1978)
3) LCtalk vol. 35, pp. 8-9 (1995)

Post-scriptum :

Même avec les mêmes conditions analytiques, si un réfractomètre est utilisé comme détecteur, il peut provoquer des pics négatifs. En effet, lorsque la phase mobile est dégazée en ligne, l'indice de réfraction est plus élevé que lorsqu'elle n'est pas dégazée.¹⁾ Non seulement l'oxygène, mais aussi l'azote est impliqué. Cela sera discuté ultérieurement, si le temps le permet.