L'horreur de l'adsorption des échantillons sur les conteneurs (partie 3)
Naoki Asakawa,
Technical Advisor, Analytical & Measuring Instruments Division,
Shimadzu Corporation
Les Parties 1 et 2 ont décrit les mécanismes d'adsorption des échantillons aux conteneurs, et comment réduire cette adsorption en utilisant des fioles à faible adsorption commercialisées (LabTotal Vial et TORASTTM-H Bio Vial). Récemment, il y a eu un certain nombre de demandes pour le développement d'un embout de pipette en polypropylène (PP) à faible adsorption (embout PP). Ces demandes proviennent d'utilisateurs qui ont reconnu que l'absorption aux embouts PP standard, souvent utilisés pour l'échantillonnage, la dilution et d'autres aspects de la préparation des échantillons, est un préjudice à la fiabilité des résultats d'analyse.
En conséquence, dans la continuité de la TORAST-H Bio Vial, le groupe Shimadzu a commencé à évaluer l'adsorption aux embouts PP, ainsi qu'au développement d'un embout PP à faible adsorption, et pour la première fois au monde a maintenant commercialisé le TORAST-H Tip. Dans cette section, nous introduisons le phénomène d'adsorption aux embouts PP, fournissons un aperçu du TORAST-H Tip, et décrivons son effet de réduction de l'adsorption.
Adsorption aux Embouts PP
L'adsorption aux embouts PP consiste principalement en une adsorption hydrophobe. Par conséquent, la méthode de réduction de l'adsorption la plus courante consiste à ajouter un solvant organique (comme le méthanol ou l'acétonitrile) à la solution d'échantillon (voir Partie 1). Cependant, en raison de l'augmentation de la vitesse de l'analyse LC et LC/MS ces dernières années, les tailles des particules de remplissage et les tailles des colonnes ont été miniaturisées. En conséquence, lorsque des solutions d'échantillons avec une grande quantité de solvant organique sont appliquées aux colonnes LC en mode phase inverse, les pics sont élargis par les solvants organiques dans les échantillons et, dans de nombreux cas, une séparation suffisante n'est pas obtenue.
Dans de tels cas, la réponse actuelle consiste à limiter le volume d'injection de l'échantillon ou la quantité de solvants organiques ajoutés à l'échantillon. Cependant, en raison de cela, la capacité de séparation inhérente et la détection haute sensibilité de la LC et de la LC/MS peuvent ne pas être suffisamment démontrées. Par conséquent, afin de maximiser les performances de la LC et de la LC/MS, des solutions d'échantillons sans solvant organique seraient préférables. Le développement d'embouts PP qui suppriment l'adsorption hydrophobe, préoccupant dans de tels cas, est donc très significatif.
Développement de l'Embout TORAST-H
Le groupe Shimadzu a commercialisé la fiole PP à faible adsorption TORAST-H Bio Vial, avec le soutien de nombreux utilisateurs. Dans cet embout, un polymère de haut poids moléculaire ultra-hydrophile/non ionique est chimiquement lié à l'embout PP (non traité), supprimant l'adsorption hydrophobe à la surface de l'embout PP (Fig. 1).
Fig. 1 Aperçu de l'Embout TORAST-H
Cette liaison chimique est très stable, ce qui signifie que les échantillons peuvent être préparés avec une large gamme de solvants.
Effet de Réduction de l'Adsorption du TORAST-H Tip
Afin de vérifier la suppression de l'adsorption par le TORAST-H Tip, le degré d'adsorption a été vérifié pour cet embout, un embout non traité, et un embout disponible dans le commerce, en utilisant des peptides et des substances basiques comme échantillons modèles.
1) Peptides
Les peptides ont été introduits comme sujet en raison de leur adsorption significative aux conteneurs (voir Partie 2). Dans ce cas, des échantillons de myoglobine digérée par la trypsine (≒1,9 pmol/mL) ont été placés dans des TORAST-H Bio Vials en utilisant le TORAST-H Tip, un embout non traité (l'embout de base du TORAST-H Tip), et un embout disponible dans le commerce, pour former des solutions d'échantillons. La Fig. 2 montre les chromatogrammes pour chaque solution d'échantillon, obtenus par HPLC.
Colonne : Aeris Peptide (diamètre interne de 2,1 mm, longueur de 150 mm, taille des particules de 1,7 µm)
Phase mobile : solution aqueuse à 0,1 % de TFA/solution d'acétonitrile à 0,1 % de TFA, élution en gradient
Détection : Ultraviolet 216 nm
À chaque pic de peptide (No. 1 à 16), aucune différence dans les surfaces de pic pour les peptides hydrophiles (No. 1 à 9 avec de petits temps de rétention) n'était évidente en fonction de l'embout (Fig. 3).
Fig. 3 Adsorption de la Myoglobine Digérée par la Trypsine aux Embouts PP
(Chromatogramme Agrandi : Pic No. 1 à 9)
En revanche, concernant les surfaces de pic pour les peptides hydrophobes (No. 10 à 16 avec de grands temps de rétention), des différences significatives étaient évidentes en fonction de l'embout. Avec l'embout non traité et l'embout disponible dans le commerce, la surface de pic a été extrêmement réduite, de 60 % à 90 % en comparaison avec le TORAST-H Tip (Fig. 4). Cela suggère que l'adsorption à l'embout PP est causée par l'adsorption hydrophobe. En même temps, cela révèle que les peptides sont significativement adsorbés aux embouts PP, même à des concentrations d'échantillons détectables par UV. En revanche, le TORAST-H Tip a montré une suppression significative de l'adsorption en comparaison avec l'embout non traité et l'embout disponible dans le commerce.
Fig. 4 Adsorption de la Myoglobine Digérée par la Trypsine aux Embouts PP
(Chromatogramme Agrandi : Pic No. 10 à 16)
2) Substances Basiques
L'adsorption au TORAST-H Tip et à un embout non traité a été comparée par LC/MS (Nexera X2 et LCMS-8050) pour des échantillons à faible concentration (solutions aqueuses de 1 ng/mL et 10 ng/mL) en utilisant l'imipramine, un antidépresseur hautement hydrophobe, et l'aténolol, un bêta-bloquant hautement hydrophile, comme composés modèles.
i) Imipramine
L'imipramine (logP : 4,28) est un médicament hautement hydrophobe pour lequel l'adsorption aux surfaces PP est une préoccupation. En comparaison avec le TORAST-H Tip, la surface de pic pour l'embout non traité a diminué de 66 % à 10 ng/mL, et de 74 % à 1 ng/mL. Ces résultats montrent que l'imipramine est facilement adsorbée à la surface de l'embout PP. Inversement, ces résultats suggèrent que le TORAST-H Tip a un effet significatif de réduction de l'adsorption (Fig. 5).
Fig. 5 Adsorption de l'Imipramine (1 ng/mL et 10 ng/mL) aux Embouts PP
(Chromatogramme par LC/MS)
ii) Aténolol
L'aténolol (logP : 0,43) est un médicament hautement hydrophile. Une faible adsorption aux surfaces des embouts PP est facilement supposée. Une solution aqueuse de 1 ng/mL d'aténolol a été échantillonnée par un TORAST-H Tip et un embout non traité, respectivement, puis transférée dans des TORAST-H Bio Vials pour former des solutions d'échantillons. Les surfaces de pic pour ces échantillons ont été comparées en utilisant la LC/MS. Avec l'embout non traité, la surface de pic a légèrement diminué en comparaison avec le TORAST-H Tip. Ensuite, comme expérience modèle dans laquelle un échantillon à faible concentration était postulé, la zone de contact avec l'embout a été augmentée cinq et 10 fois. La surface de pic avec l'embout non traité a diminué de 17 % et 30 %, respectivement. Ces résultats suggèrent que même pour des composés hautement hydrophiles comme l'aténolol, les échantillons à faible concentration sont adsorbés à l'embout PP
La série de résultats initiaux introduite dans la Partie 3 implique l'évaluation réelle de l'adsorption des échantillons à faible concentration aux embouts PP. Les embouts PP sont faciles à utiliser lors de la préparation des échantillons à faible concentration, mais augmenteront la variabilité des résultats d'analyse. En revanche, le TORAST-H Tip a démontré une suppression de l'adsorption par rapport à l'embout PP lors de la préparation des échantillons à faible concentration. Par conséquent, en combinaison avec le TORAST-H Bio Vial, la contribution de ce produit à la fiabilité des analyses LC/MS et autres analyses à haute sensibilité est fortement anticipée.
