Fig.2 Chromatogramme de la protéine après purification du plasma humain
Chromatographie d'exclusion de taille (SEC)
La chromatographie d'exclusion par taille (SEC) permet de séparer les composés en fonction des différences de taille moléculaire.
La Fig.1 montre les mécanismes de la SEC. Le matériau de remplissage utilisé dans la colonne contient de nombreux pores. Lorsque des molécules de différentes tailles traversent la colonne, les petites molécules s'écoulent lentement tout en pénétrant profondément dans les pores du matériau de remplissage (Fig. 1, à droite), tandis que les grandes molécules s'écoulent hors de la colonne sans pénétrer dans les pores (Fig. 1, à gauche). En conséquence, l'ordre d'élution de la colonne est plus rapide pour les grandes molécules et plus lent pour les petites molécules. La SEC est un mode de séparation qui tamise les molécules en fonction de leur taille. C'est le principe de la séparation par SEC.
Fig.1 Les mécanismes de la SEC
Gauche : Molécules de “grande” taille
Droite : Molécules de “petite” taille
Théoriquement, en l'absence d'interaction chimique, tous les composés sont élués de la colonne entre la "limite d'exclusion" et la "limite de perméation". La limite d'exclusion est définie comme le volume d'élution (temps de rétention) lorsqu'une grande molécule traverse les pores sans y pénétrer du tout. La limite de perméation est le volume d'élution lorsqu'une petite molécule pénètre dans tous les pores et est éluée.
La SEC est également appelée "Chromatographie par perméation de gel (GPC)" ou "Chromatographie par filtration sur gel (GFC)". Le Tableau 1 montre les caractéristiques des deux méthodes. La GPC est une méthode de mesure de la distribution des poids moléculaires des polymères synthétiques en utilisant une phase stationnaire hydrophobe et un solvant organique. La GFC est une méthode d'analyse et de fractionnement des polymères hydrophiles (c'est-à-dire peptide, protéine et polysaccharide) en utilisant une phase stationnaire hydrophile et une solution aqueuse. La GFC est également appelée "SEC aqueuse".
Tableau 1 Caractéristiques de la "GPC" et de la "GFC"
| Méthode | Cible | Phase stationnaire | Phase mobile |
|---|---|---|---|
| Chromatographie par perméation de gel (GPC) | Mesure de la distribution des poids moléculaires des polymères synthétiques | Hydrophobicité | Non aqueuse (Solvant organique) |
| Chromatographie par filtration sur gel (GFC) | Mesure de la distribution des poids moléculaires / Analyse et fractionnement des polymères hydrosolubles | Hydrophilie | Aqueuse |
La Fig.2 montre le chromatogramme de la protéine purifiée à partir d'un échantillon de sérum humain. Pour estimer le poids moléculaire de la protéine à partir du pic obtenu dans la Fig.2, un mélange de solution standard de composés polymères hydrosolubles (Haut : Thyroglobuline (669 kDa), Aldolase (158 kDa), Ovalbumine (44 kDa), Bas : Ferritine (440 kDa) et Conalbumine (75 kDa)) a été analysé (Fig.3).
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Fig.3 Chromatogrammes de la solution standard de polymères hydrosolubles
D'après les résultats montrés dans la Fig.3, on peut voir que les composés polymères hydrosolubles sont élués de la colonne dans un ordre décroissant de poids moléculaire.
Le poids moléculaire approximatif de la protéine purifiée peut être calculé en analysant des composés polymériques hydrosolubles de poids moléculaire connu comme marqueurs et en comparant leurs temps de rétention avec les résultats analytiques de la Fig.2.
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