Détection de l'absorbance : Détecteurs ultraviolets et détecteurs à barrettes de photodiodes
La détection de l'absorbance est la méthode de détection la plus courante en analyse HPLC.
La lumière est un type d'onde électromagnétique, et les ondes électromagnétiques sont appelées différemment selon leurs longueurs d'onde. La Fig.1 montre les types d'ondes électromagnétiques et leurs longueurs d'onde correspondantes.
Fig.1 Le spectre électromagnétique
Lorsqu'une substance est irradiée par la lumière, elle absorbe la lumière d'une longueur d'onde spécifique, et l'énergie des électrons passe de leur état fondamental (état le plus bas) à un état excité (état à haute énergie). La longueur d'onde de la lumière absorbée dépend de la structure de la substance. La lumière dans la gamme ultraviolette à visible est utilisée pour la détection de l'absorbance.
La Fig.2 montre le principe de la détection de l'absorbance en analyse HPLC. L'absorbance est mesurée en surveillant le taux de diminution de la quantité de lumière qui traverse la cellule lors de l'irradiation de la solution dans la cellule de flux avec une lumière d'une longueur d'onde particulière. L'absorbance est proportionnelle à la concentration de la substance cible. Cela peut être défini comme la loi de Lambert-Beer.
Fig.2 Principe de la détection de l'absorbance en analyse HPLC (Haut : Mesure de l'absorbance, Bas : Loi de Lambert-Beer)
La concentration du composant peut être calculée en mesurant le changement d'absorbance de la phase mobile passant à travers la cellule de flux du détecteur. Selon la loi de Lambert-Beer, l'absorbance est proportionnelle à la concentration du composant, mais en pratique, une concentration trop élevée empêche le détecteur d'obtenir une mesure précise, comme le montre la Fig.2. Par conséquent, il est nécessaire de quantifier dans une gamme de concentrations qui garantit une proportion linéaire avec le taux d'absorbance, également connue sous le nom de gamme dynamique.
La Fig. 3 montre un schéma d'un détecteur ultraviolet (UV). Une lampe au deutérium (D2) est utilisée comme source de lumière ultraviolette pour le détecteur UV. La lumière émise par la lampe est séparée en un faisceau lumineux d'une certaine longueur d'onde avec un réseau de diffraction, puis passe à travers la cellule de flux. La lumière qui traverse la cellule de flux entre dans le photodétecteur (photodiode) et est convertie en un signal électrique correspondant à l'intensité de la lumière, qui est traité comme absorbance. Un détecteur UV-visible avec une lampe D2 et une lampe tungstène est adapté pour surveiller non seulement les ultraviolets mais aussi la lumière visible.
La Fig. 4 montre un schéma d'un détecteur à réseau de photodiodes (PDA *). La lumière émise par une lampe installée dans le détecteur PDA traverse la cellule de flux puis est séparée avec un réseau de diffraction. Lorsque le faisceau lumineux séparé est reçu par une photodiode, qui est une séquence de 1 024 photodétecteurs, seules les longueurs d'onde dans la plage spécifiée sont converties en signaux électriques et traitées comme des données d'absorbance. ＊Dans certains cas, cela est appelé détecteur à réseau de diodes (DAD).
Fig.3 Schéma d'un détecteur UV
Fig.4 Schéma d'un détecteur PDA
Fig.5 Données obtenues avec un détecteur PDA
L'utilisation d'un détecteur PDA permet de mesurer un spectre UV continu, ce qui donne un chromatogramme multi-longueurs d'onde. Le détecteur fournit non seulement un chromatogramme qui se réfère au temps sur l'axe X et à l'absorbance sur l'axe Y, comme obtenu avec le détecteur UV, mais également des données tridimensionnelles ayant un axe de longueur d'onde sur l'axe Z (Fig.5).
La Fig. 6 montre un exemple d'analyse des absorbants ultraviolets, qui sont des ingrédients actifs dans les cosmétiques, en utilisant un détecteur PDA. Comme le montre la figure de gauche de la Fig. 6, l'analyse utilisant un détecteur PDA peut obtenir des chromatogrammes multi-longueurs d'onde en une seule fois. La figure de droite montre un spectre UV au sommet de chaque pic de composé.
La différence dans la longueur d'onde d'absorption maximale du spectre UV de chaque composant permet une analyse simultanée à différentes longueurs d'onde. L'identification utilisant un détecteur UV compare uniquement les temps de rétention du composé cible dans les échantillons standard et inconnus, tandis que les détecteurs PDA comparent les spectres UV en plus du temps de rétention.
Fig.6 Analyse des absorbants UV dans les cosmétiques avec un détecteur PDA
Fig.7 Identification basée sur le spectre UV
La Fig. 7 montre une superposition des spectres UV de l'échantillon et des spectres UV standards pour le pic B détecté à 310 nm. Les spectres UV des composés détectés dans les cosmétiques sont supposés être les mêmes composés que la substance standard car les deux spectres UV coïncident. L'utilisation de détecteurs PDA permet d'obtenir un spectre UV, ce qui permet une analyse qualitative plus fiable.
Informations de support
De plus, certains produits permettent le traitement logiciel des données obtenues à l'aide d'un détecteur PDA pour séparer les pics non séparés et étendre la gamme dynamique.
