Effets des solvants de l'échantillon sur la forme des pics

L'échantillon injecté par l'automate d'injection atteint la colonne de séparation par le biais du tubage. Si le mélange du solvant de l'échantillon et de la phase mobile est insuffisant avant que le solvant de l'échantillon n'atteigne la colonne, la forme du pic peut se détériorer en fonction du type de solvant de l'échantillon. La forme du pic peut s'élargir lors de l'utilisation d'un solvant d'échantillon avec une intensité d'élution supérieure à celle de la phase mobile. De plus, l'utilisation du système UHPLC qui emploie des tubes de diamètre intérieur plus petit est susceptible d'être affectée par un mélange inadéquat du solvant de l'échantillon et de la phase mobile.

La Fig. 1 montre l'effet de la force d'élution du solvant de l'échantillon sur la forme du pic, en utilisant le nombre de plateaux théoriques lors de l'analyse de la caféine par chromatographie en phase inverse comme exemple. Le paramètre de la forme du pic est représenté par le nombre de plateaux théoriques (TPN), qui indique la netteté du pic. Dans ce cas, le mélange de méthanol/eau (3:7) est utilisé pour la phase mobile. En comparant les TPNs lors de l'utilisation de méthanol comme solvant d'échantillon, qui a une force d'élution supérieure à celle de la phase mobile, et de l'eau, qui a une force inférieure, vous pouvez voir qu'il y a une différence dans les TPNs. Lorsque le volume d'injection est encore augmenté, vous pouvez voir qu'il y a une différence remarquable. La Fig. 2 montre une comparaison du volume d'injection et de la forme du pic lorsque le méthanol est utilisé comme solvant d'échantillon. La concentration de l'échantillon est ajustée de sorte que la quantité d'injection absolue soit la même. On peut voir que la forme du pic se détériore à mesure que le volume d'injection augmente.

La Fig. 3 décrit une image des analytes et des solvants d'échantillon se déplaçant à travers la colonne. Le solvant d'échantillon peut être considéré comme une partie de la phase mobile dans la colonne, mais l'utilisation d'un solvant d'échantillon avec une force d'élution plus élevée peut déplacer les analytes plus rapidement, comme s'il s'agissait d'une phase mobile. En revanche, pour l'utilisation d'un solvant d'échantillon avec une force d'élution plus faible, l'analyte se concentre initialement puis commence à nouveau à se séparer dans la phase mobile car le solvant d'échantillon agit comme une phase mobile avec une force d'élution plus faible. L'utilisation d'un solvant d'échantillon avec une force d'élution inférieure à celle de la phase mobile peut affiner la forme du pic car la diffusion de l'analyte peut être supprimée dans la colonne.

Fig.3 Comparaison de la rétention en utilisant 2 types de solvant d'échantillon avec des forces d'élution différentes
 

Comme mentionné ci-dessus, il est expliqué que la différence de force d'élution entre le solvant de l'échantillon et la phase mobile affecte la forme du pic. Elle peut être affinée en utilisant un solvant d'échantillon avec une force d'élution inférieure à celle de la phase mobile, mais si l'échantillon est préparé avec un solvant ayant une force d'élution plus élevée (par exemple, 100 % de méthanol en RP-LC), il y a un risque de problèmes de prétraitement supplémentaire tels que la substitution et la dilution.

Fig.4 Image du processus d'injection

Les échantillonneurs automatiques des séries Nexera (série LC-40) et i-Series sont équipés en standard de diverses fonctions de prétraitement automatique telles que la fonction de co-injection. La Fig. 4 décrit le processus d'opération en mode co-injection. L'utilisation de ce mode permet au solvant de co-injection d'être automatiquement aspiré à partir d'un flacon spécifique et injecté avec l'échantillon dans la colonne analytique. Par conséquent, un pic net peut être obtenu sans avoir à remplacer ou diluer manuellement. La Fig. 5 montre une comparaison des chromatogrammes avec et sans co-injection de solvant de dilution (eau) dans l'analyse d'échantillons préparés avec un solvant ayant une force d'élution supérieure à celle de la phase mobile en analyse en phase inverse. Cette comparaison est le résultat d'une analyse en augmentant progressivement le volume d'injection du diluant. Les chromatogrammes obtenus avec co-injection montrent que l'augmentation du volume d'injection ne contribue pas à la forme du pic, résultant en des pics nets dans toutes les analyses.
 

Fig.5 Comparaison de la forme du pic lorsque le diluant est co-injecté
 

Dans l'analyse des résidus de pesticides et de médicaments vétérinaires, seul le solvant organique, le méthanol à 100 %, peut être remplacé par le solvant de l'échantillon lors de la préparation pour l'extraction en phase solide. En particulier, lorsque les analytes sont des composés hautement polaires en chromatographie en phase inverse, une combinaison d'un ratio élevé d'eau comme phase mobile et d'un solvant d'échantillon ayant une force d'élution plus élevée tend à provoquer une détérioration de la forme du pic. La co-injection avec la fonction de prétraitement automatique permet une analyse garantissant une fiabilité quantitative et obtenant une bonne forme de pic. 
 

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