Méthodes de rinçage pour les colonnes ODS

Une colonne ODS est remplie d'un garnissage de groupes octadécylsilyle (groupes ODS ou groupes C18) chimiquement liés à un support de gel de silice. Les colonnes ODS sont utilisées pour la chromatographie en phase inverse. Les colonnes ODS trouvent une large gamme d'applications en raison de leur nombre élevé de plateaux théoriques et de leur équilibrage rapide. Leur faible coût en fait les colonnes les plus utilisées pour la HPLC.

Cependant, divers problèmes peuvent survenir lors de l'utilisation de ces colonnes. Les causes et symptômes typiques sont présentés ci-dessous. Les explications suivantes couvrent les méthodes de rinçage pour éliminer les composants adsorbés.

(1) Surface du garnissage de colonne ODS (phase stationnaire)

Lors de la considération de la méthode de rinçage, il est important de penser aux forces d'adsorption agissant sur les composants. Tout d'abord, nous allons passer en revue ce que nous savons sur la surface du garnissage ODS.

Des groupes hydroxyle sont initialement attachés à la surface du support de gel de silice dans une structure Si-OH. Cela s'appelle le "silanol". Le garnissage ODS est formé en liant des groupes ODS au silanol par des réactions chimiques. Cependant, comme le groupe ODS est volumineux et peu réactif, beaucoup de silanol non réagi reste.

Comme ce silanol résiduel peut avoir divers effets indésirables* pendant l'analyse, le silanol est coiffé par des réactions avec des groupes triméthylsilyle (TMS), qui ne sont pas volumineux (sont hautement réactifs). Cette opération est connue sous le nom de "capping", "triméthylsilylation" ou "silylation secondaire". Cependant, une petite quantité de silanol restera toujours à la surface et les groupes ODS peuvent être progressivement éliminés pour créer du silanol dans la colonne ODS pendant l'analyse.

(2) Rinçage des composants retenus par interaction hydrophobe

Le terme "interaction hydrophobe" indique une affinité entre les zones de composant à faible polarité et un groupe ODS à faible polarité. C'est la force de rétention utilisée par la véritable chromatographie en phase inverse. Les zones de faible polarité incluent les groupes alkyle et les anneaux aromatiques. En haut du diagramme à droite, un groupe propyle du composant est attiré par un groupe ODS.
Une phase mobile à faible polarité est utilisée pour rincer les composants retenus par cette force. Si 1/1 de méthanol/eau est utilisé comme phase mobile pour l'analyse, augmenter le rapport de méthanol à 3/1, par exemple, abaisse la polarité de la solution de rinçage et facilite le rinçage des composants avec une forte force de rétention qui restent dans la colonne.
Il faut tenir compte de la compatibilité lors du changement de phase mobile. Si une solution tampon est utilisée au lieu de l'eau dans l'exemple ci-dessus, des sels peuvent précipiter si le rapport de solvant organique est soudainement augmenté. Si un mélange de solution tampon/solvant organique est utilisé comme phase mobile pour l'analyse, la colonne et la ligne de flux doivent d'abord être rincées avec un mélange eau/solvant organique * du même ratio avant d'augmenter le rapport de solvant organique.
Pendant le rinçage, surveillez avec le détecteur pour déterminer si la ligne de base est stabilisée.

(3) Rinçage des composants adsorbés par liaison hydrogène ou liaison ionique

Comme discuté en (1) ci-dessus, une petite quantité de silanol reste à la surface du garnissage. L'hydrogène du silanol attire les électrons vers l'oxygène pour créer une charge électrique statique quelque peu positive. Par conséquent, l'hydrogène a la propriété de former une liaison hydrogène avec le doublet non liant (charge statique quelque peu négative) sur l'azote dans le composant. (Rangée du milieu du diagramme ci-dessus à droite) Dans une phase mobile légèrement acide ou neutre, cette liaison hydrogène adsorbe des composants basiques et provoque un étalement. (Le silanol forme des liaisons ioniques à un pH plus élevé.) Les composants basiques fortement adsorbés ne peuvent pas être rincés par des solvants organiques.
Dans ce cas, une solution de rinçage acide doit être utilisée pour restreindre la liaison hydrogène en coordonnant un ion hydrogène avec le doublet non liant sur l'azote (protonation).
R-NH₂ → R-NH₃⁺
Faites une solution de rinçage acide en ajoutant environ 0,1 % d'acide phosphorique ou d'acide acétique.

Généralement, on pense que les composants fortement retenus à l'intérieur de la colonne incluent de tels composants basiques. C'est une raison pour laquelle l'ajout d'acide est bénéfique pour le rinçage en (2) ci-dessus. Ne pas rincer à l'eau si des composants basiques restent dans la colonne (y compris lorsque des composés basiques sont utilisés comme réactif de paire d'ions). Le rinçage à l'eau augmente le pH autour des composants adsorbés, rendant le gel de silice facile à dissoudre. Ajouter de l'acide aide à éviter ce problème.

Cependant, certains composants sont difficiles à éliminer simplement en rendant la phase mobile acide. C'est le cas des cations avec un grand rayon ionique, tels que le tétrabutylammonium.

Dans ce cas, on pense que la liaison ionique se produit avec la charge négative du silanol dissocié. (Haut du diagramme)
La liaison ionique devient plus forte à mesure que le rayon ionique augmente. Le diagramme ci-dessous montre le cas où un groupe amino terminal est positivement chargé dans des conditions acides. En raison de la forte densité de charge, plusieurs niveaux d'hydratation se produisent, ce qui rend difficile l'approche des anions. Cependant, comme l'hydratation est faible pour les ions ammonium entourés de groupes alkyle volumineux, les anions peuvent s'approcher plus facilement.

Référence : Lors de la chromatographie d'échange d'ions, l'élution des ions commence par les ions avec un petit rayon ionique : F^-, Cl^- et Br^-. Cela indique que la liaison ionique devient plus forte à mesure que le rayon ionique augmente.

Pour affaiblir la liaison ionique, utilisez une solution de rinçage acide contenant des anions de grand rayon* comme paires d'ions. L'acidité supprime la dissociation du silanol.
* Par exemple, ajoutez environ 0,1 M de perchlorate de sodium. Bien que le perchlorate de sodium soit un sel inorganique, il a les propriétés de se dissoudre dans 100 % de méthanol ou d'acétonitrile et de ne pas précipiter facilement. Comme les ions perchlorate forment facilement des paires d'ions dans la phase mobile, il peut également être utilisé pour la chromatographie de paire d'ions. (Cependant, c'est un réactif dangereux. Ne le chauffez pas et ne le mettez pas près d'une flamme nue. Diluez le liquide de déchet à un état neutre et éliminez-le par un prestataire de services de gestion des déchets agréé.)

Supplément

Lorsque le silanol se dissocie, il porte une charge négative. Lorsqu'il est lié à des ions métalliques, il favorise l'adsorption de composés de coordination et de composés acides. Pour rincer les ions métalliques, une espèce ionique compétitive ou un agent de masquage des métaux est ajouté à la solution de rinçage. De plus, comme il est souhaitable de restreindre la dissociation du silanol, abaisser le pH de la phase mobile/solution de rinçage est efficace.

De plus, rendre la solution acide affaiblit la coordination des composés de coordination et restreint la dissociation du groupe carboxyle dans les composés acides. Cependant, comme le gel de silice est le plus stable autour de pH 4, l'utilisation de solutions extrêmement acides sur une longue période est interdite. Idéalement, utilisez une petite quantité d'acide phosphorique ou d'acide acétique.

4. Résumé

Nous avons décrit ci-dessus que la procédure la plus courante pour utiliser un mélange de solvant organique/solution tampon comme phase mobile pour l'analyse est : 1) rincer avec un mélange de solvant organique/eau acide du même ratio de mélange, 2) rincer en utilisant une solution de rinçage acide avec une proportion accrue de solvant organique, 3) si l'inclusion de composés fortement basiques est attendue, ajouter du perchlorate de sodium à la solution de rinçage.

Cependant, la méthode de rinçage optimale diffère pour chaque analyse. Lors de la détermination de la méthode de rinçage, gardez toujours à l'esprit ce que contient l'échantillon et quelle phase mobile est utilisée.
Les restrictions d'utilisation peuvent différer, même si les colonnes ODS utilisent le même support de gel de silice. Lisez attentivement le manuel d'instructions.