Préparation de la phase mobile

-Les différences dans la méthode de préparation peuvent entraîner des chromatogrammes différents -

Un solvant à base d'eau, un solvant organique, ou un mélange des deux est principalement utilisé comme phase mobile pour la HPLC. Une solution tampon est souvent utilisée comme solvant aqueux. LCtalk38 LAB Préparation des solutions tampons décrit les méthodes de préparation réelles pour les solutions tampons typiques utilisées avec la HPLC. Cependant, il semble que beaucoup de gens aient une compréhension floue des solutions tampons.

Si la méthode de préparation n'est pas la même que celle décrite dans le matériel pour la méthode d'analyse, des différences peuvent survenir dans la phase mobile qui affectent les chromatogrammes et les résultats d'analyse. En dehors de la solution tampon, de nombreux autres facteurs imprévus affectent la préparation de la phase mobile, comme la méthode de mélange du solvant.

Ici, nous utilisons des exemples concrets pour examiner les effets de la méthode de préparation de la phase mobile sur les résultats d'analyse.

1) Préparation des solutions tampons

En pratique, comment préparons-nous une solution tampon désignée comme "20 mM solution tampon d'acide phosphorique (pH=2.5)" ? Examinons quelques problèmes possibles.
Tout d'abord, nous savons qu'il s'agit d'une solution tampon d'acide phosphorique, mais quel est l'ion contre-ion ? Si les ions sodium sont sans ambiguïté l'ion contre-ion, "20 mM" fait-il référence à la concentration d'acide phosphorique ou à la concentration de phosphate de sodium ?

Pour une solution tampon d'acide phosphorique (sodium) à 20 mM, "20 mM" pourrait être considéré comme la concentration d'acide phosphorique. D'autre part, considérer "20 mM" comme la concentration de sodium, la solution tampon pourrait être une solution tampon préparée en ajustant le pH à l'aide d'une solution aqueuse de dihydrogénophosphate de sodium à 20 mM. (Cependant, une solution aqueuse de dihydrogénophosphate de sodium à 20 mM a un pH juste en dessous de 5, donc un ajustement du pH avec un type d'acide est nécessaire pour atteindre le pH 2.5.)
Cependant, un effet de paire d'ions dû à l'acide utilisé pour l'ajustement du pH pourrait affecter les résultats d'analyse. Cela peut être potentiellement dangereux, car cela conduit à plusieurs interprétations possibles d'une solution tampon désignée.

L'exemple ci-dessus conduit à trois interprétations potentielles. La Fig. 1 montre comment cela affecte les résultats d'analyse.
Dans la rangée du haut, "20 mM" est interprété comme la concentration d'acide phosphorique. Les résultats d'analyse ont été obtenus en utilisant un solvant préparé comme "20 mM solution tampon d'acide phosphorique (sodium) (pH 2.5)" comme phase mobile.
Dans les rangées du milieu et du bas, "20 mM" est interprété comme la concentration de dihydrogénophosphate de sodium. La phase mobile a été préparée en ajoutant de l'acide phosphorique ou de l'acide perchlorique pour ajuster le pH à 2.5.
Ces différences peuvent affecter significativement le temps de rétention, comme indiqué pour la dihydrocodéine dans l'exemple, et peuvent entraîner des problèmes avec la robustesse de la méthode d'analyse. Identifier clairement la solution tampon lors de la spécification de la méthode de préparation peut prévenir les problèmes dus à des différences d'interprétation.

2) Mélange de solvants organiques et de solvants à base d'eau

Une solution mixte de solvants organiques et de solvants aqueux est souvent utilisée comme phase mobile. La manière dont ils sont mélangés peut entraîner de grandes différences dans les résultats d'analyse. Considérons un exemple de 90 % de solution tampon et 10 % d'acétonitrile. (La solution tampon est un dihydrogénophosphate de sodium à 20 mM ajusté à pH 2.5 par l'ajout d'acide phosphorique.) Un rapport de mélange de 9:1 peut être interprété comme un rapport de volume de 9:1 de solution tampon et d'acétonitrile. C'est-à-dire que les volumes équivalents sont mesurés et mélangés ensemble.

D'autre part, il est possible d'interpréter cela comme un contenu d'acétonitrile de 10 %, c'est-à-dire que l'acétonitrile doit être dilué dix fois avec la solution tampon. Cela entraîne une réduction de volume due au mélange, de sorte qu'une solution tampon excédentaire est ajoutée. On peut penser qu'il n'y a pas grande différence entre les deux. Une attention particulière est requise, car le type de mélange peut avoir un effet remarquable sur les résultats d'analyse (en particulier, le temps de rétention), comme le montre la Fig. 2.
En général, lors de la préparation de la phase mobile pour la chromatographie liquide à haute performance, la proportion est souvent désignée comme Liquide A : Liquide B = 3 : 2 (V/V). C'est-à-dire que l'équivalent du rapport de volume 3 de Liquide A et l'équivalent du rapport de volume 2 de Liquide B sont mesurés séparément et mélangés ensemble. (En pratique, cela entraîne un volume de mélange légèrement inférieur à l'équivalent du total théorique "5" pour les deux liquides (3 + 2).)

Le problème ci-dessus concerne également la préparation de solutions d'échantillons et d'autres solutions, et pas seulement la préparation de la phase mobile.
Chaque domaine (comme les produits pharmaceutiques et le génie chimique) a sa propre sagesse conventionnelle et ses coutumes, ce qui entraîne encore plus de confusion. Gardez à l'esprit d'utiliser toujours des indications appropriées pour éviter toute confusion. En cas d'incertitude, consultez un recueil officiel, tel que la Pharmacopée japonaise, les Méthodes standard d'analyse pour la chimie hygiénique, les Normes industrielles japonaises (JIS), qui couvrent les règles et règlements pour la préparation de solutions.
(J.Ma)