Stabilisation de la ligne de base lors de l'utilisation de détecteurs d'indice de réfraction
Les détecteurs à indice de réfraction (RID) sont largement utilisés pour de nombreuses substances, comme pour analyser des composants avec une faible absorption UV, mais ils nécessitent du temps pour stabiliser la ligne de base, ce qui a sans doute été une source de frustration pour de nombreux utilisateurs. Cette page discute du savoir-faire concernant la stabilisation de la ligne de base en se concentrant sur la chromatographie d'exclusion de taille (SEC) non aqueuse, en utilisant principalement du tétrahydrofurane (THF) comme éluant.
Ajustement de la Température du Détecteur
Changement de l'Indice de Réfraction en Réponse au Changement de Température de la Cellule
L'indice de réfraction est fortement affecté par la température de la solution. Par conséquent, de nombreux RID disponibles dans le commerce sont conçus pour contrôler la température autour de la cellule de flux afin de garantir que sa température reste aussi constante que possible. Alors, dans quelle mesure de petites variations de la température du détecteur affectent-elles la ligne de base?
La Figure 1 montre un exemple de données obtenues lorsque la température de la cellule de flux a été changée de 40,0 °C à 40,1 °C. Bien qu'il ne s'agisse que d'une différence de température de 0,1 °C, cela fait clairement fluctuer la ligne de base. Cela s'est probablement produit en raison d'une différence de taux de chauffage entre la cellule de flux de l'échantillon, avec l'éluant qui y circule, et la cellule de référence, avec l'éluant piégé à l'intérieur.
En réalité, la cellule de flux est contrôlée en température, donc la ligne de base ne fluctuerait pas autant si la température du laboratoire changeait de seulement 0,1 °C. Cependant, si la température de la pièce change soudainement ou si le système HVAC souffle de l'air sur le détecteur, le système de contrôle de la température du détecteur ne peut parfois pas suivre ces changements. Par conséquent, des mesures doivent être prises pour maintenir la température de la pièce aussi constante que possible, ou pour envelopper les lignes de flux entrant dans le détecteur avec une isolation.
Ajustement de la Teneur en Air Dissous dans les Éluants
Une des caractéristiques des RID est qu'ils détectent également l'air dissous dans les éluants. Par conséquent, pour stabiliser la ligne de base, il est nécessaire de mettre en œuvre des mesures pour s'assurer que l'état de dégazage de l'éluant reste constant. La Figure 2 compare l'ampleur des fluctuations de la ligne de base, dans les résultats obtenus en utilisant de l'eau et du THF comme éluant, lorsque l'unité de dégazage a été activée après que la ligne de base se soit stabilisée avec l'unité de dégazage désactivée.
Changement de l'Indice de Réfraction Lorsque l'Unité de Dégazage Passe de OFF à ON Sans colonne, débit de 1,0 mL/min, et unité de dégazage DGU-20A3
Ce graphique montre deux choses.
1) La diminution de l'air dissous dans l'éluant augmente l'indice de réfraction
2) Le changement d'indice de réfraction est plus important pour le THF que pour l'eau.
Le point 1) indique une tendance opposée à la détection UV près de 200 nm. Pour la détection UV, un niveau plus élevé d'air dissous augmente normalement le niveau d'absorption.
Le point 2) indique que, en général, plus la polarité d'un solvant est faible, plus l'effet d'un changement d'air dissous sur l'indice de réfraction est important. Cela est dû au fait que les solvants non polaires dissolvent l'air plus facilement que les solvants polaires (voir : Mécanisme de Génération des Bulles d'Air), ce qui entraîne un changement plus important de l'air dissous après l'activation de l'unité de dégazage.
Ceux qui ont de l'expérience avec la SEC aqueuse et non aqueuse ont probablement plus de difficulté à stabiliser la ligne de base en SEC non aqueuse qu'en SEC aqueuse. En SEC non aqueuse, la détection de l'indice de réfraction (ou la détection de l'absorption UV près de 200 nm) nécessite une attention particulière pour contrôler le niveau d'air dissous.
L'unité de dégazage DGU-20A3 utilisée dans ce cas utilise une membrane de séparation gaz-liquide* avec une perméabilité à l'air supérieure à celle des modèles précédents et des lignes de flux avec environ 1/20 du volume des modèles précédents. Cela réduit considérablement le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre après le début du dégazage.
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En raison des matériaux des lignes de flux, certains solvants ne peuvent pas être utilisés dans ce système, comme l'hexafluoroisopropanol. Sélectionnez soigneusement les solvants utilisés dans l'éluant. |
De plus, sachez qu'un dégazage hors ligne excessif, tel qu'avec une unité de dégazage sous vide utilisant un aspirateur, peut entraîner une redissolution progressive de l'air dans l'éluant après le dégazage hors ligne, de sorte que la variation de la teneur en air dissous empêche la stabilisation de la ligne de base.
Ajustement de la Température des Éluants
La Figure 3 montre les résultats obtenus en immergeant la bouteille d'éluant dans un bain d'eau et en enregistrant les fluctuations de la ligne de base lorsqu'elle est chauffée de 25 °C à 35 °C.
Changement de l'Indice de Réfraction en Réponse au Changement de Température de la Bouteille d'Éluant Sans colonne, éluant : THF, et débit : 1,0 mL/min
Même si le RID et le four de la colonne sont maintenus à une température constante, le simple fait de changer la température de la bouteille d'éluant peut faire fluctuer la ligne de base. Une raison est probablement que la quantité d'air dissous varie en fonction de la température du liquide. Plus la température des liquides est élevée, plus il est difficile pour l'air de s'y dissoudre. Par conséquent, chauffer l'éluant réduit la teneur en air dissous, ce qui entraîne une augmentation de l'indice de réfraction.
Cet effet peut être quelque peu inhibé en utilisant une unité de dégazage efficace, mais si la ligne de base ne se stabilise pas, mettez en œuvre des mesures pour maintenir non seulement la température de la colonne et du détecteur, mais aussi pour maintenir la température de la bouteille d'éluant constante. De plus, commencez les analyses après que les liquides se soient ajustés à la température ambiante et enveloppez la bouteille d'éluant avec une isolation.
Inhibition du Changement de Composition dans les Éluants
La composition du THF et du chloroforme peut changer lorsqu'ils sont exposés à l'air pendant de longues périodes, en raison de l'oxydation ou d'autres facteurs, un stabilisateur est ajouté pour empêcher de tels changements. Dans de nombreux cas, le butylhydroxytoluène (BHT) est ajouté comme stabilisateur dans le THF de qualité réactif. En revanche, le THF de qualité HPLC est vendu sans stabilisateur et scellé dans du gaz d'azote, en raison de la forte absorption UV du BHT et d'autres facteurs. Alors, quel réactif devriez-vous choisir?
En général, si vous utilisez un détecteur où la détection du BHT est susceptible d'interférer avec la mesure, alors un réactif sans stabilisateur doit être sélectionné. D'autre part, comme le stabilisateur inhibe les changements de composition du THF, il est probablement approprié de sélectionner le réactif avec stabilisateur chaque fois que le BHT n'interfère pas directement avec les mesures.
Cela est résumé dans le Tableau 1.
Tableau 1 THF Avec/Sans Stabilisateur Versus Détecteurs
Détecteurs pour lesquels un réactif contenant un stabilisateur doit être utilisé
- Détecteurs à indice de réfraction
Détecteurs pour lesquels un réactif sans stabilisateur doit être utilisé
- Détecteurs UV (surtout pour les longueurs d'onde courtes près de 200 nm)
- Détecteurs de diffusion de la lumière par évaporation
- Systèmes LC/MS et LCMS/MS
Si le réactif sans stabilisateur est utilisé, assurez-vous d'enregistrer la date d'ouverture de la bouteille de réactif et soyez conscient du temps écoulé depuis l'ouverture. Une fois le solvant ouvert, idéalement, il doit être stocké à l'abri de la lumière dans un récipient hermétique rempli d'azote. Si une série d'analyses doit s'étendre sur une longue période, la bouteille d'éluant doit probablement être légèrement pressurisée avec du gaz d'azote, même pendant les analyses. (Pour plus de détails, contactez le fabricant du réactif.) Plutôt que d'acheter plus de THF que nécessaire, nous recommandons d'acheter des quantités plus petites plus fréquemment, même si cela est légèrement plus coûteux.
De plus, par temps humide, les fluctuations de la ligne de base causées par l'absorption d'humidité peuvent être inhibées en installant un tube de déshumidification rempli de gel de silice dans l'ouverture de la bouteille d'éluant. (Gt)
