Formes anormales des pics
Avez-vous déjà rencontré une situation lors d'une analyse HPLC où vous avez pensé : "quelque chose ne va pas avec ces formes de pic."? Les formes de pic anormales sont un problème courant lors des travaux d'analyse de routine. Les anomalies de pic clairement visibles dans les chromatogrammes incluent l'élargissement des pics (y compris les traînées ou les bords avant extrêmes), les pics en épaule et les pics divisés, comme illustré à la Figure 1.
Figure 1 : Exemples de Formes de Pic Anormales
Si l'une de ces anomalies de pic apparaît dans les chromatogrammes, elles peuvent être causées par les facteurs indiqués à la Figure 2. Cet article discute des principales causes des formes de pic anormales.
Figure 2 : Principales Causes des Formes de Pic Anormales
Détérioration de la Colonne
- Si les formes de pic commencent à ressembler à celles de la Figure 1 alors que l'analyse est effectuée de manière habituelle, la cause la plus probable est la détérioration de la colonne (y compris la contamination). Si une colonne de garde est installée avant la colonne analytique, vérifiez la forme du pic après avoir retiré la colonne de garde. Si les pics reviennent à la normale, le problème vient de la colonne de garde.
- La détérioration de la colonne peut survenir en raison d'un changement dans l'état du garnissage de la colonne, d'une accumulation de composants contaminants, d'un blocage par des microparticules, d'une désorption de la phase solide ou d'autres facteurs. L'état du garnissage peut changer en raison d'une exposition à des charges de pression à long terme ou d'une détérioration du matériau de base du garnissage (dissolution du gel de silice, par exemple). Dans de nombreux cas, un léger écart se développe dans le matériau de garnissage à l'entrée de la colonne, ce qui peut provoquer des pics en épaule ou des pics divisés. Le blocage par des microparticules (provenant des solutions d'échantillon, des phases mobiles, des pompes, des unités d'injection d'échantillon, etc.) ou les accumulations de composants contaminants peuvent se produire dans les filtres installés du côté de l'entrée des colonnes ou dans le matériau de garnissage près de l'entrée. L'adsorption des composants de l'échantillon aux accumulations de contaminants ou aux microparticules inhibant le flux des composants de l'échantillon peut modifier les formes de pic. La désorption de la phase solide peut non seulement modifier la forme du pic, mais aussi raccourcir les temps de rétention.
- Si une détérioration de la colonne est suspectée, rincez la colonne. Pour des instructions sur les méthodes de rinçage des colonnes, consultez le manuel d'instructions de la colonne. Si des résultats adéquats ne peuvent pas être obtenus après le rinçage, les colonnes peuvent parfois être rincées à contre-courant. (La solution de rinçage est pompée dans le sens opposé à faible débit à travers la colonne, depuis l'extrémité de sortie de la colonne.) Cependant, assurez-vous de vérifier dans le manuel d'instructions de la colonne ou une autre source que la colonne peut être rincée à contre-courant. Si le rinçage ou le rinçage à contre-courant ne résout pas le problème, la colonne a atteint sa durée de vie.
Solvant d'Échantillon ou Volume d'Injection Inappropriés
- Cela se réfère aux cas où des formes de pic anormales se produisent après avoir changé la composition du solvant d'échantillon ou le volume d'injection, en raison du prétraitement ou de la concentration de la substance analysée. Dans de tels cas, confirmez d'abord la forme du pic après avoir utilisé le solvant d'échantillon et le volume d'injection précédents.
- Des exemples des effets de la composition du solvant d'échantillon sur la forme du pic sont montrés à la Figure 3. Les chromatogrammes (a) et (b) sont des résultats obtenus en utilisant le même instrument pour analyser des solutions de mélange standard préparées en utilisant deux types différents de solvants d'échantillon.
Bien que cela ne soit pas perceptible en regardant le chromatogramme (b) seul, une comparaison avec le chromatogramme (a) montre clairement un élargissement des pics dans le chromatogramme (b). Le même ratio de solvant organique est utilisé pour le solvant d'échantillon dans (a) (eau/acétonitrile = 3/1) que pour la phase mobile (solution tampon citrate/acétonitrile = 3/1), mais seul l'acétonitrile, qui est un solvant fort pour le mode phase inverse, a été utilisé comme solvant d'échantillon dans (b). Cet exemple montre comment les solvants forts peuvent affecter la forme du pic si le ratio de solvant fort dans le solvant d'échantillon devient élevé.
Figure 3 : Effets des Solvants d'Échantillon sur la Forme du Pic
- Le volume d'injection de l'échantillon est lié à l'élargissement de la zone de l'échantillon dans la première étape de la séparation sur colonne. Par conséquent, augmenter le volume d'injection peut entraîner un élargissement du pic. En particulier, plus le ratio de solvant fort dans le solvant d'échantillon est élevé, plus les effets sont importants.
Volume Mort dans les Lignes de Flux
- Si les pics s'élargissent après avoir utilisé des tubages différents (mais avec le même diamètre interne), cela peut être dû à un volume mort aux connexions des tubages (entre l'unité d'injection d'échantillon, la colonne et le détecteur) par lesquels les échantillons passent. Un exemple de volume mort est montré à la Figure 4.
Figure 4 : Volume Mort dans la Connexion de la Ligne de Flux
- La longueur du tubage dépassant du connecteur diffère selon le fabricant. C'est particulièrement important pour les connexions de colonne. Si un nouveau tubage est installé, insérez le tubage complètement dans le joint et pressez-le contre le côté opposé pendant que le connecteur est serré.
Gradients de Température à l'Intérieur des Colonnes
- Si vous utilisez des débits élevés, des températures de colonne élevées ou une colonne avec un grand diamètre interne, par exemple, et que la phase mobile s'écoule à travers la colonne sans être suffisamment chauffée, un gradient de température peut se former dans la direction transversale de la colonne. (La température est plus basse au centre de la colonne que près des parois internes de la colonne.) Cela peut provoquer un élargissement des pics.
- Les effets des gradients de température peuvent être supprimés en allongeant le tubage (en acier inoxydable) entre l'unité d'injection d'échantillon et la colonne pour préchauffer la phase mobile dans le four de la colonne. Cependant, cela peut également provoquer un élargissement des pics dans le tubage de préchauffage, ce qui nécessite d'optimiser le diamètre interne et la longueur.
Réglage de Réponse du Détecteur Inapproprié
- En général, le bruit peut être réduit en modifiant le réglage de réponse du détecteur (également appelé constante de temps). Un réglage de réponse plus lent peut réduire le bruit, ce qui est bénéfique pour une analyse à haute sensibilité, mais cela entraîne également un élargissement des pics. Des exemples des effets de la réponse sur la forme du pic sont montrés à la Figure 5.
Figure 5 : Effets de la Réponse sur la Forme du Pic
- La Figure 5 montre comment plus les pics sont éludés tôt, plus ils sont affectés par le réglage de réponse. Par conséquent, par précaution, vérifiez le réglage de réponse avant de commencer l'analyse.
