Méthodes analytiques pour les acides organiques

En tant que composant clé qui détermine l'"umami" (saveur ou goût) dans les aliments, les acides organiques rivalisent avec les acides aminés et les sucres en tant que l'une des substances les plus couramment analysées. Cette page discute des méthodes d'analyse des acides organiques utilisant la HPLC.

Méthodes de Séparation

Les trois principaux modes de séparation des acides organiques sont l'échange d'anions, l'exclusion des ions et la phase inverse. Les caractéristiques de chacun de ces modes sont brièvement décrites ci-dessous.

Cependant, en réalité, une interaction hydrophobe se produit également avec une partie du substrat de garnissage (styrène-divinylbenzène), ce qui peut retarder l'élution des acides organiques hydrophobes en particulier. Par exemple, l'acide valérique élue beaucoup plus tard que l'acide acétique bien qu'il y ait peu de différence dans leurs valeurs de pKa. Cela est dû au fait que l'acide valérique est retenu plus fortement en raison d'une interaction hydrophobe avec le matériau du substrat.

De cette manière, une combinaison de trois facteurs - exclusion électrostatique due à la phase stationnaire chargée négativement, interaction hydrophobe avec la matrice de la phase stationnaire et pénétration dans les pores de la phase stationnaire, détermine les temps d'élution. Ce mode est largement utilisé car c'est une méthode simple qui nécessite un ajustement minimal des paramètres de la phase mobile.

Mode Phase Inverse
Ce mode offre la plus large applicabilité pour la HPLC, mais il n'est pas très largement utilisé pour analyser les acides organiques. Cela est dû au fait que les acides organiques sont hydrophiles, ce qui peut souvent empêcher une rétention ou une sélectivité adéquates. Cependant, des colonnes en phase inverse commerciales qui peuvent retenir suffisamment même les substances hautement hydrophiles sont récemment devenues disponibles sur le marché.

Note : Les valeurs de pKa ont été obtenues à partir de Seikagaku Deta Bukku (Manuel de Biochimie) (1979) et Kagaku Binran Kiso-Hen (Manuel de Chimie Générale), 2e éd. (1975). Une comparaison de diverses références a indiqué une différence allant jusqu'à 0,3, mais ces valeurs étaient proches de celles des références datées depuis 2000, telles que le Merck Index, les ressources académiques sur la chimie aux États-Unis, les dictionnaires chimiques et les dictionnaires biochimiques. Par conséquent, ces anciennes références avec des données documentées respectives ont été utilisées.

Méthodes de Détection

La méthode de détection la plus simple, la détection UV directe, détecte l'absorption du groupe carboxyle dans la plage de 200 à 210 nm. Cependant, il existe de nombreuses substances organiques avec une absorption dans cette plage de longueurs d'onde, ce qui peut entraîner une interférence significative des contaminants et rendre difficile la quantification précise des composants à moins que l'échantillon ne soit très pur. Les détecteurs d'indice de réfraction peuvent également être utilisés, mais en plus d'une sélectivité plus faible, ils ont également un problème de sensibilité. La détection directe en utilisant un détecteur de conductivité électrochimique est une autre méthode, mais elle nécessite de réduire la conductivité électrochimique de fond de la phase mobile.

Les méthodes de détection post-colonne qui peuvent détecter sélectivement les acides organiques avec une haute sensibilité incluent l'indicateur de pH - détection par absorption visible et le tampon de pH - détection par conductivité électrochimique. La méthode de l'indicateur de pH utilise un changement de couleur de l'indicateur de pH pour détecter les acides organiques, mais elle présente des problèmes de linéarité et de facilité d'utilisation. En revanche, la méthode de tampon de pH offre une excellente sensibilité, sélectivité et précision.

Méthode de Tampon de pH

Typiquement, une phase mobile acide est utilisée dans le mode d'exclusion des ions, qui est largement utilisé pour l'analyse des acides organiques. Cela signifie que la dissociation est inhibée pour les acides faibles tels que les acides organiques. De plus, comme la conductivité électrochimique de fond est élevée, l'utilisation d'un détecteur de conductivité électrochimique dans ces conditions ne fournira pas une sensibilité adéquate. Par conséquent, dans cette méthode de tampon de pH, un tampon de pH est continuellement ajouté à l'effluent de la colonne pour ajuster le pH à un niveau proche de la neutralité pour promouvoir la dissociation des acides organiques et réduire le bruit de fond. L'effluent est ensuite dirigé vers un détecteur de conductivité électrochimique qui peut détecter les acides organiques avec une haute sensibilité et sélectivité.
La figure à droite montre un exemple de la relation entre le pH de l'éluant et le niveau de dissociation pour l'acide acétique. Au niveau de pH à l'intérieur de la colonne (environ 3), il n'y a presque pas de dissociation de l'acide acétique. Cela entraîne une exclusion ionique faible dans la colonne, ce qui permet une bonne séparation des autres acides organiques. En revanche, le pH est neutre à l'entrée du détecteur, donc presque tout l'acide acétique est dissocié. Cela montre que promouvoir la dissociation en utilisant un réactif tampon de pH de cette manière permet une détection avec une haute sensibilité.
En d'autres termes, cette méthode "fait d'une pierre deux coups" en réduisant le niveau de fond de la phase mobile, tout en augmentant la sensibilité en favorisant la dissociation de l'acide organique.