Méthodes d'analyse des acides aminés

La HPLC est la méthode la plus populaire pour analyser les composants d'acides aminés, qui ont actuellement attiré l'attention en raison de l'engouement pour les aliments santé. Cette page discute principalement des méthodes de détection utilisées pour analyser les acides aminés.

Types de Méthodes de Détection

Utiliser la détection UV pour les acides aminés nécessite dans la plupart des cas d'utiliser l'absorption du groupe carboxyle (-COOH) dans la plage de 200 à 210 nm. Certains acides aminés avec des anneaux benzéniques peuvent également être détectés dans la plage de 250 à 280 nm, mais en général, ils sont difficiles à analyser tels quels avec une sensibilité et une sélectivité suffisantes.
Par conséquent, des méthodes de dérivation sont utilisées depuis longtemps. Comme de nombreux acides aminés contiennent des groupes amino (-NH₂ et -NHR) dans leurs structures, un réactif de dérivation qui réagit sélectivement avec le groupe amino est utilisé.

Méthode de Dérivation Pré-Colonne (méthode de pré-étiquetage)

Dans la dérivation pré-colonne, les acides aminés sont dérivés avant l'injection, puis les produits de réaction sont séparés et détectés. Ce concept est illustré à droite. Les "étiquettes" indiquées représentent le réactif de dérivation.

Les avantages de cette méthode sont les suivants :

• En général, les taux de consommation de réactif peuvent être minimisés en spécifiant un petit système de réaction.


• Permet d'augmenter la sensibilité en utilisant des réactifs plus coûteux qui fournissent des niveaux de fond plus bas (que la dérivation post-colonne).


• Même si le réactif de dérivation non réagi est détecté, tant qu'il est séparé dans la colonne, cela ne pose pas de problème.

D'un autre côté, un inconvénient est que, parce que le réactif de dérivation est mélangé directement avec l'échantillon, l'efficacité de réaction (rendement) est facilement influencée par la matrice de l'échantillon (tels que les composants coexistants et les types de solvants). Par conséquent, la dérivation pré-colonne peut être considérée comme appropriée lorsqu'on envisage d'analyser une variété d'échantillons quelque peu limitée avec une haute sensibilité. Les réactifs de dérivation pré-colonne les plus couramment utilisés pour l'analyse des acides aminés sont l'o-phthalaldéhyde, l'isothiocyanate de phényl (PITC), la fluorescamine et le chlorure de dansyle. Les procédures de réaction varient largement, allant du simple mélange à température ambiante, pour une réaction qui progresse rapidement, aux réactions nécessitant un chauffage ou des protocoles nécessitant un nettoyage post-réaction. Dans de nombreux cas, la chromatographie en phase inverse est utilisée pour séparer les produits de réaction. Normalement, la chromatographie en phase inverse n'est pas bien adaptée pour séparer des substances hautement hydrophiles telles que les acides aminés. Cependant, parce que la dérivation pré-colonne dérive les échantillons avant qu'ils ne soient introduits dans la colonne, les acides aminés peuvent être modifiés avec des groupes fonctionnels hautement hydrophobes pour permettre la chromatographie en phase inverse. Étant donné que les méthodes en phase inverse fournissent une excellente séparation, elles permettent une analyse extrêmement rapide, en fonction de la configuration des paramètres. Ce qui suit est un exemple utilisant un système Prominence UFLC et une colonne en phase inverse Shim-pack XR-ODS pour séparer les dérivés d'acides aminés PTC (dérivés en utilisant un réactif PITC).

Méthode de Dérivation Post-Colonne (méthode de détection par réaction post-colonne)

La méthode de dérivation post-colonne consiste à séparer les acides aminés dans la colonne, puis à livrer et mélanger le réactif de dérivation pour le laisser réagir avec les acides aminés, avant d'envoyer finalement les produits au détecteur. Un schéma de la ligne de flux d'un processus typique de dérivation post-colonne est montré à droite.

Les avantages de cette méthode sont les suivants :

• Peut être automatisée offrant d'excellentes performances quantitatives et reproductibilité.


• Étant donné que les composants de l'échantillon sont séparés avant la réaction, l'efficacité de la réaction est moins sujette aux effets de la matrice de l'échantillon, ce qui permet de l'utiliser pour une large gamme d'échantillons.

En revanche, ses inconvénients incluent la difficulté d'augmenter la sensibilité et la consommation élevée de réactif de réaction, qui est maintenu en flux constant.
En se basant sur ces facteurs, une fois le système de réaction optimisé, la dérivation post-colonne peut être appliquée à une large gamme d'échantillons, être considérée comme une technique offrant d'excellentes performances quantitatives et appropriée pour l'analyse de routine.
Étant donné que le réactif de réaction s'écoule en continu vers le détecteur, la dérivation post-colonne est limitée par l'interdiction de détecter le réactif non réagi, ce qui limite les types de réactifs qui peuvent être utilisés. Actuellement, il existe principalement deux types de réactifs disponibles pour l'analyse des acides aminés, la ninhydrine et l'o-phthalaldéhyde. Le premier est pour la détection par absorption visible et le second est pour la détection par fluorescence.

La méthode la plus couramment utilisée pour la séparation est la chromatographie par échange de cations. Les acides aminés sont des zwitterions qui incluent à la fois des groupes amino et carboxyle dans leur structure. Par conséquent, plus l'acidité de l'acide aminé est élevée (plus il est susceptible de former un anion) pendant l'échange de cations, plus l'élution est rapide, tandis que plus la basicité de l'acide aminé est élevée (plus il est susceptible de former un cation), plus l'élution est lente. D'ailleurs, bien que la phase inverse soit actuellement la principale méthode utilisée pour la HPLC, pourquoi utilise-t-on l'échange de cations ? L'échange de cations est utilisé parce qu'il permet de séparer facilement et efficacement les acides aminés les uns des autres et de les séparer des substances contenant des groupes amino (amines).
Pour les acides aminés hautement hydrophiles, la chromatographie en phase inverse pourrait ne pas fournir une rétention ou une sélectivité adéquate. L'utilisation de la méthode d'échange de cations sépare efficacement plusieurs acides aminés.

De plus, étant donné que le réactif de dérivation utilisé pour l'analyse des acides aminés réagit avec les groupes amino, il réagira également avec les amines typiques. Ces amines pourraient être détectées sous forme de pics sur le chromatogramme. Cependant, la plupart des amines n'ont pas de groupe fonctionnel anionique, tel qu'un groupe carboxyle, comme les acides aminés, elles ont donc tendance à être plus basiques que les acides aminés et élueront plus lentement si la méthode d'échange de cations est utilisée. En d'autres termes, l'utilisation de la méthode d'échange de cations empêche les amines d'interférer avec la quantification des acides aminés.
De cette manière, combiner la chromatographie par échange de cations, qui permet de séparer les acides aminés les uns des autres ou des autres amines, avec la détection dérivée post-colonne, qui permet de réagir sélectivement avec les acides aminés, constitue un "mariage" idéal de méthodes.

Le chromatogramme suivant est un exemple d'analyse d'une boisson populaire aux acides aminés utilisant la dérivation post-colonne avec l'o-phthalaldéhyde. (Gt)