A propos de la résolution, Part 2
Expression relationnelle entre la résolution, le nombre de plaques théoriques, le facteur de séparation et le facteur de rétention
L'équation (1) montre la relation entre la résolution (R), le nombre de plaques théoriques (N), le facteur de séparation (α) et le facteur de rétention (k). (Cela suppose que les largeurs des deux pics sont égales et que k est le facteur de rétention du pic arrière.)
Lors de l'amélioration de la résolution, quelle contribution le nombre de plaques théoriques, le facteur de séparation et le facteur de rétention apportent-ils ? Les explications ci-dessous sont basées sur l'équation (1).
Nombre de plaques théoriques
Comme la résolution est proportionnelle à la racine carrée du nombre de plaques théoriques dans l'équation (1), doubler le nombre de plaques théoriques augmente la résolution d'un facteur de √2￣= 1,41 ; augmenter le nombre de plaques théoriques quatre fois augmente la résolution d'un facteur de √4￣= 2.
Supposons que la colonne utilisée ait 10 000 plaques théoriques et que la résolution entre deux pics soit de 0,8. Si la colonne est remplacée pour atteindre une résolution de 1,5 (séparation complète), quel nombre de plaques théoriques est requis ?
Dans ce cas, la résolution doit être améliorée d'un facteur de 1,5/0,8 = 1,9. En supposant que le facteur de séparation et le facteur de rétention restent inchangés, il peut être vu que le nombre de plaques théoriques doit être augmenté d'un facteur de 1,92=3,6, c'est-à-dire à 36 000. (Fig. 1).
Si le même remplissage de colonne est utilisé, le nombre de plaques théoriques peut être augmenté en prolongeant la longueur de la colonne. Dans cet exemple, la longueur de la colonne doit être augmentée de 3,6 fois.
Fig. 1 : Nombre de plaques théoriques et séparation
Cependant, les nouvelles colonnes UHPLC (chromatographie liquide à ultra haute performance) avec une taille de particule de remplissage de 2 μm offrent désormais un nombre plus élevé de plaques théoriques sans augmenter la longueur de la colonne. De telles colonnes nécessitent un instrument HPLC capable de supporter une pression élevée pour gérer les pressions accrues de la colonne.
Facteur de séparation
Le diagramme à gauche de la Fig. 2 montre l'effet du facteur de séparation sur la résolution à partir de l'équation (1), c'est-à-dire la relation entre α et (α-1)/α. Comme le facteur de séparation est le rapport de deux facteurs de rétention de pics, il varie en fonction de diverses conditions, telles que la phase stationnaire de remplissage, le pH de la phase mobile (pour l'analyse des espèces ioniques), le type de solvant organique de la phase mobile et la température de la colonne. Il est évident d'après la Fig. 2 que, jusqu'à environ 1,2, le facteur de séparation a une relation approximativement linéaire avec l'augmentation de la résolution. Si le facteur de séparation était de 1,1 à une résolution de 0,8 dans l'exemple introduit ci-dessus, alors la résolution peut être augmentée à 1,5 en réglant le facteur de séparation à environ 1,2. C'est un moyen efficace d'améliorer la résolution. Cependant, il faut un certain temps pour optimiser les conditions.
Facteur de rétention
Comme le facteur de séparation ci-dessus, la relation entre k et k/(1+k) est montrée dans le diagramme à droite de la Fig. 2. Le facteur de rétention augmente lorsqu'une phase mobile avec une force d'élution plus faible est utilisée. Par conséquent, la proportion de solvant organique peut être réduite en chromatographie en phase inverse, par exemple. Cependant, le diagramme à droite de la Fig. 2 montre que le facteur de rétention contribue à une plus grande résolution uniquement pour les pics qui s'éludent rapidement. Par conséquent, augmenter le facteur de rétention de 3 à 9, par exemple, n'améliore la résolution que d'un facteur de 1,2 mais entraîne des temps d'analyse plus longs.
Fig. 2 : Relation du facteur de séparation et du facteur de rétention à la séparation
L'exemple ci-dessus montre que l'équation (1) donne une compréhension des concepts fondamentaux nécessaires pour améliorer la résolution.
