Vue d'ensemble de l'HPLC ：Qu'est-ce que l'HPLC ？

L'HPLC est l'abréviation de Chromatographie Liquide Haute Performance. "Chromatographie" est une technique de séparation, "chromatogramme" est le résultat de la chromatographie, et "chromatographe" est l'instrument utilisé pour effectuer la chromatographie.

Parmi les diverses technologies développées pour la chromatographie, les appareils dédiés à la séparation moléculaire appelés colonnes et les pompes haute performance pour délivrer le solvant à un débit stable sont quelques-uns des composants clés des chromatographes. À mesure que les technologies connexes sont devenues plus sophistiquées, le système communément appelé Chromatographie Liquide Haute Performance est simplement devenu appelé "LC". De nos jours, la Chromatographie Liquide Ultra Haute Performance (UHPLC), capable d'analyses à grande vitesse, est également devenue plus répandue.

Seuls les composés dissous dans des solvants peuvent être analysés par HPLC. L'HPLC sépare les composés dissous dans un échantillon liquide et permet une analyse qualitative et quantitative des composants et de la quantité de chaque composant contenue dans l'échantillon.

La Fig.1 montre un aperçu de base du processus HPLC. Le solvant utilisé pour séparer les composants d'un échantillon liquide pour l'analyse HPLC est appelé phase mobile. La phase mobile est délivrée à une colonne de séparation, également connue sous le nom de phase stationnaire, puis au détecteur à un débit stable contrôlé par la pompe de délivrance de solvant. Une certaine quantité d'échantillon est injectée dans la colonne et les composés contenus dans l'échantillon sont séparés. Les composés séparés dans la colonne sont détectés par un détecteur en aval de la colonne et chaque composé est identifié et quantifié.

2　L'appareil de l'HPLC

Le “Aperçu de base du processus HPLC" (Comme montré dans la Fig.1) et ses mécanismes ont maintenant été couverts. Pour entrer dans plus de détails, l'HPLC se compose de divers composants, y compris une pompe de délivrance de solvant, une unité de dégazage, un injecteur d'échantillon, un four à colonnes, un détecteur et un processeur de données. La Fig.2 montre le diagramme de flux de l'HPLC et le rôle de chaque composant.

Fig.2　Diagramme de flux HPLC

 

En ce qui concerne l'HPLC, la pompe délivre la phase mobile à un débit contrôlé (a). L'air peut facilement se dissoudre dans la phase mobile sous la pression atmosphérique standard dans laquelle nous vivons. Si la phase mobile contient des bulles d'air et entre dans la pompe de délivrance, des problèmes tels que des fluctuations du débit et du bruit/dérive de la ligne de base peuvent survenir. L'unité de dégazage aide à prévenir ce problème en éliminant les bulles d'air dans la phase mobile (b). Après que l'air dissous a été retiré, la phase mobile est délivrée à la colonne. L'injecteur d'échantillon introduit ensuite une solution standard ou une solution d'échantillon dans la phase mobile (c). Les fluctuations de température peuvent affecter la séparation des composés dans la colonne. La colonne est placée dans un four à colonnes pour maintenir la température constante (d). Les composés élus de la colonne sont détectés par un détecteur qui est placé en aval de la colonne (e). Un poste de travail traite le signal du détecteur pour obtenir un chromatogramme afin d'identifier et de quantifier les composés (f).

3　Séparation HPLC

L'HPLC peut séparer et détecter chaque composé par la différence de vitesse de chaque composé à travers la colonne. La Fig.3 montre un exemple de séparation HPLC.

Il y a deux phases pour l'HPLC : la phase mobile et la phase stationnaire. La phase mobile est le liquide qui dissout le composé cible. La phase stationnaire est la partie d'une colonne qui interagit avec le composé cible.

Dans la colonne, plus l'affinité (par exemple ; force de van der Waals) entre le composant et la phase mobile est forte, plus le composant se déplace rapidement à travers la colonne avec la phase mobile. En revanche, plus l'affinité avec la phase stationnaire est forte, plus il se déplace lentement à travers la colonne. La Fig. 3 montre un exemple dans lequel le composant jaune a une forte affinité avec la phase mobile et se déplace rapidement à travers la colonne, tandis que le composant rose a une forte affinité avec la phase stationnaire et se déplace lentement. La vitesse d'élution dans la colonne dépend de l'affinité entre le composé et la phase stationnaire.

Fig.3　Un exemple de séparation HPLC

4　Comment lire un chromatogramme

Le mot "chromatogramme" désigne un graphique obtenu par chromatographie. La Fig.4 montre un exemple de chromatogramme. Le chromatogramme est un graphique bidimensionnel avec l'axe vertical montrant la concentration en termes d'intensité du signal du détecteur et l'axe horizontal représentant le temps d'analyse. Lorsque aucun composé n'est élu de la colonne, une ligne parallèle à l'axe horizontal est tracée. Cela s'appelle la ligne de base. Le détecteur réagit en fonction de la concentration du composé cible dans la bande d'élution. Le graphique obtenu ressemble davantage à la forme d'une cloche qu'à celle d'un triangle. Cette forme est appelée un “pic”.

Le temps de rétention (tR) est l'intervalle de temps entre le point d'injection de l'échantillon et le sommet du pic. Le temps requis pour les composés non retenus (composés sans interaction avec la phase stationnaire) pour passer de l'injecteur au détecteur est appelé le temps mort (t0).

La hauteur du pic (h) est la distance verticale entre le sommet d'un pic et la ligne de base, et la zone du pic (A) colorée en bleu clair est la zone délimitée par le pic et la ligne de base. Ces résultats seront utilisés pour l'analyse qualitative et quantitative des composants d'un échantillon.

Fig.4　Chromatogramme et termes associés