Phases mobiles compatibles avec le LCMS
Chromatographie liquide-spectrométrie de masse
Comme la MS fonctionne sous vide élevé, il est nécessaire de s'assurer que les paramètres LC et les phases mobiles (entrée de liquide) sont compatibles avec la MS. Habituellement, lors du passage de l'analyse LC à la LCMS, les conditions LC actuelles peuvent être utilisées si la phase mobile est volatile. Si elle est non volatile (par exemple, tampon phosphate), des modifications (par exemple, mode de chromatographie, colonne, type et volatilité de la phase mobile) sont nécessaires. Cela doit être étudié étape par étape pour permettre une meilleure interface avec la LCMS. Comme mentionné au chapitre 1, il existe une variété de modes de séparation pour la LC (Tableau 1) et les types de phase stationnaire et de phase mobile peuvent être modifiés en fonction des caractéristiques de l'échantillon, du niveau de séparation souhaité, du niveau d'ionisation et de la compatibilité avec la MS.
Un bon point de départ serait d'utiliser des phases mobiles volatiles. Une liste des phases mobiles adaptées à l'API et à la LCMS est résumée dans le Tableau 3. En plus des phases mobiles fondamentales telles que l'eau, le méthanol et l'acétonitrile, l'acide acétique est également couramment utilisé pour ajuster le niveau de pH. Pour les solutions tampons, des sels volatils tels que l'acétate d'ammonium et le formiate d'ammonium sont utilisés. De plus, des réactifs d'appariement d'ions volatils peuvent être ajoutés à la phase mobile pour faciliter la séparation des composés polaires en utilisant la LC en phase inverse. Ces réactifs, qui ont une longue chaîne hydrophobe et un groupe ionique polaire, ont tendance à se fixer à la phase stationnaire de la colonne avec le groupe ionique orienté vers l'extérieur. En présence de réactifs d'appariement d'ions, les composés polaires interagissent avec les groupes ioniques chargés du réactif d'appariement d'ions et sont retenus et séparés dans la colonne en phase inverse. En mettant l'accent sur l'efficacité de l'ionisation, les solvants protiques sont essentiels pour générer des ions de réaction pour l'APCI, et les solvants polaires sont essentiels pour l'ESI car ils sont nécessaires pour dissoudre les composés polaires ou ioniques.
| Solvants de phase mobile fondamentaux | Réactifs d'ajustement du pH (volatiles, ≦10mM) |
|---|---|
| a) Alcools (par ex. méthanol, éthanol, propanol) b) Acétonitrile (ACN)*1 c) Eau (pH ajusté, si nécessaire) |
Acides a) Acide acétique b) Acide formique c) Trifluoroacétate (TFA) Base d) Ammoniaque aqueuse Tampons e) Acétate d'ammonium f) Formiate d'ammonium |
| Réactifs d'appariement d'ions relativement volatils*2 | Solvant organique utilisable*3 |
| Pour retenir les composés basiques a) Perfluorocarbonate, C2 à C8 Pour retenir les composés acides b) Dibutylamine, c) Triéthylamine (TEA) |
a) Diméthylsulfoxyde (DMSO) b) Diméthylformamide (DMF) c) Tétrahydrofurane (THF) d) Acétone e) Esters f) Chloroforme g) Benzène h) Hexane |
- *1 L'acétonitrile n'est pas compatible avec l'APCI en raison de la réduction du nitrile en carbone pour l'ionisation négative. Dans ce cas, le méthanol doit être utilisé à la place.
- *2 Utiliser au minimum car ces substances peuvent rester dans le système LC et MS même après avoir changé la phase mobile. Il est nécessaire de rincer le système LC pour éliminer toute trace de ces agents d'appariement d'ions.
- *3 Si un "solvant de phase mobile fondamental" est présent, il ne pose généralement pas de problème si la phase mobile contient certains de ces solvants organiques. (Cependant, l'effet d'ionisation diminue à mesure que la concentration de solvants organiques utilisables augmente.)
Un point clé à noter est que les sels non volatils, tels que la solution tampon phosphate, ne conviennent pas à une utilisation en LCMS. Les sels non volatils forment des précipités à l'interface LCMS, ce qui entraîne immédiatement une diminution de la sensibilité en affectant les champs électriques appliqués pour l'ionisation et le transfert des ions. Cela peut également causer des dommages physiques, tels que la contamination de l'électrode à aiguille pour l'APCI ou en induisant une décharge électrique (étincelle). De plus, les solvants non polaires, tels que l'hexane, contribuent très peu à l'ionisation des molécules d'échantillon en utilisant l'APCI. Par conséquent, les conditions analytiques utilisant de telles phases mobiles ne peuvent pas être utilisées sans modification.
Dans le cas où il peut y avoir des limitations dans les choix de phases mobiles et où les changer peut poser un défi pour la séparation LC, l'ajout ou les modifications post-colonne (avant la MS) peuvent être une bonne alternative. De plus, il existe la technique 2D-LC-MS/MS sans piège qui peut être utilisée pour changer la phase mobile afin d'assurer la compatibilité avec la MS. De meilleures séparations LC et une interface plus facile avec la LCMS peuvent également être obtenues en changeant le type de colonnes LC. Par exemple, si la colonne C18 (octadécyl) pour le mode phase inverse est utilisée, nous pouvons essayer de passer à la colonne C30 pour augmenter la rétention ou à la colonne C8 ou C4 pour réduire la rétention, ou à la colonne -phényl ou -CN pour augmenter la sélectivité de séparation. Si la différence dans les temps d'élution est trop grande ou si les pics sont trop larges, un programme d'élution en gradient peut être utilisé. Si la phase mobile et la concentration en sel sont adaptées à l'API, alors un mode de chromatographie différent (par exemple, exclusion de taille ou échange d'ions) peut également être utilisé.
En résumé, ce chapitre a couvert les composants de base d'un système LCMS et les différentes méthodes d'ionisation utilisées en LCMS. Les facteurs qui limitent la sensibilité des techniques API et la nécessité de sélectionner des conditions analytiques appropriées pour la LCMS sont discutés pour vous aider dans vos analyses et vous donner une meilleure compréhension de l'interface LCMS.
